Русский
Русский
English
Статистика
Реклама

В поисках драгоценностей на другом конце Brainbow


Год назад я побывала на курсе Mouse genetics; models for human diseases, проводимом International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB). За этой организацией я наблюдаю уже давно (с 2014 года) и, когда выпадает такая возможность, приезжаю к ним на конференции и воркшопы. На данный момент ICGEB охватывает 98 стран, из которых 65 являются членами организации. Украина, к сожалению, пока еще не является страной-участницей, но около 2-х лет назад был подписан договор о коллаборантстве с ICGEB. Сотрудничество государств с ICGEB сулит исследователям огромные перспективы, к примеру, возможность выполнить научную работу в сердце организации Триест (Италия) или принять грантовое участие в курсах, конференциях. Магистрам и диссертантам государств-участниц предоставляется возможность проводить исследования на новейшем оборудовании. Для Украины это жизненно важный фактор, поэтому я с нетерпением жду, когда же подписанный между Послом Украины в Италии Евгением Перелыгиным и ICGEB договор вступит в силу. Замечу, что для ученых из стран, не являющихся коллаборантами организации, двери также открыты. Но регистрационный взнос в этом случае придется платить самостоятельно.
Вернусь к рассказу о прошлогоднем курсе. Я чрезмерно радовалась возможности поучаствовать с докладом The mouse rodent model (root vole, Microtus oeconomus Pall.) in the ecotoxity bioindication. Конечно, моя тема далеко не во всех аспектах могла соревноваться с инновационными разработками, привезенными другими участники курса. А доклады сотрудников лабораторий ICGEB вообще были выше всяких похвал! Однако модельные животные это все-таки моя тема: как-никак, я проработала 4 года в Институте молекулярной биологии и генетики, моделируя всевозможные заболевания на мелких грызунах. А также у нас была GFP мышь, которая тоже используется как модельное животное. Поэтому я, опьянев от восторга, сидела и завороженно слушала докладчиков.
Должна заметить, что ранее я даже не подозревала о существовании в Германии German Mouse Clinic. Dr. Wolfgang Wurst в простой и доступной форме рассказал о секретах создания линий трансгенных животных-моделей с разными (зависящими от воли экспериментатора) генами человека. Ученый объяснил, сколь важно после получения первой генерации трансгенных животных ответственно отнестись к разведению полученных особей по соответствующим зоотехническим принципам, наращивания поголовье с постоянным контролем наличия у полученного потомства генов человека. Примерами контроля могут послужить, в том числе, обычные визуальные характеристики, к примеру, изменение шерсти животного, размера хвоста, средних размеров и т. д. К примеру, если мы моделируем гомозиготную особь по гену MSTN, то мышь будет значительно крупнее, чем представитель дикого типа). Также в его клинике для мышей используют аппарат УЗД и рентгеновских снимков. К примеру, болезнь Педжета характеризуется нарушением костного ремоделирования, что приводит к увеличению и деформации костей. На рентгене будет видны характерные изменения. Эта болезнь обусловлена мутацией в генах SQSTM1 и RANK. Доктор Вольфгант Вурст также упомянул, как об эталоне, о модели Brainbow.
Модель Brainbow направлена на картирование взаимосвязей нейронов головного мозга. Для того, чтобы создать такую модель, надо нокаутировать те гены, которые интересует биотехнолога с помощью так называемого инструмента Cre-LoxP системы. Состоит эта система из Cre-рекомбиназы и LoxP-сайтов (последовательность ДНК, состоящая из 34 пар нуклеотидов). Эта система была подсмотрена и позаимствована у природы, а именно у фага Р1. У фага Р1 эта система позволяет осуществлять нормальный жизненный цикл этого вируса со встройкой фага в геном бактерий. В эксперименте ученые вводят кассету с генами 4 флуоресцентных белков и между генами шесть LoxP-сайта (3 пары: 1, 2 и 3) таким образом, чтобы пары были направлены в одну сторону. Такой способ введения LoxP-сайтов обеспечивает вырезание участка, находящегося между идентичными LoxP-сайтами. Обеспечивает это фермент Cre-рекомбиназа. Итак, фермент Cre-рекомбиназа сворачивает молекулу ДНК таким образом, чтобы выстроить идентичные LoxP-сайты друг напротив друга, и производит перекрест между этими участками молекулы ДНК. Приводит это к тому, что участок, который находился между двумя LoxP-сайтами, оказывается заключен в петлю и в последующем вырезан из молекулы. Участки, которые были справа и слева от LoxP-сайтов, соединяются вместе. Поэтому такую систему называют нокаут так как она выключает определенные гены. Но модель Brainbow это не просто нокаут, а Conditional Knockout, то есть нокаут при определенных условиях. Для этого Cre-рекомбиназа активируется только в клетках гиппокампа. Чтобы Cre-рекомбиназа запускалась только в конкретных клетках, выбирают специальный промотор, в данном случае промотор гена THY1. В этой конструкции сразу четыре части, которые кодируют флуоресцентные белки: оранжевый, красный, желтый и синий. Если рекомбинация пройдет по сайтам первой пары, то из конструкции удалится оранжевый флуоресцентный белок, а с промотором соединится красный флуоресцентный белок. Если рекомбинация произойдет по сайтам второй пары, то удалится оранжевый и красный флуоресцентный белки, а промотор соединится с желтым. Ну и третий вариант удалится оранжевый, красный и желтый, а останется только синий. Это приводит к тому, что каждая клетка окрашивается в свой цвет. Из-за комбинаций различных флуорохромов и цветов можно достичь около 70 отдельных цветовых комбинаций, которые различимы компьютером.
Из таких клеток, где произошла успешная гомологичная рекомбинация, можно получить трансгенных животных. При скрещивании с линией мышей, имеющих ген Cre-рекомбиназы, получалось потомство, несущее и ген Cre-рекомбиназы, и многоцветную кассету. У таких мышей произойдет рекомбинация и нейроны будут окрашены, ученым несложно будет проследить, где начинаются и заканчиваются отростки нервных клеток, а, следовательно, можно отслеживать взаимосвязи нейронов головного мозга.
Модель Brainbow действительно можно назвать эталоном. Она очень изящная. Кстати, на этой неделе пролистывала новости института Богомольца и увидела видео Медэкспертиза 5 канал. Ролик посвящен вопросам изучения процессов боли, ощущений ее интенсивности и преодоления без аналгетиков. Аспирант института физиологии НАН Украины Ярослав Андрианов рассказывает о своем исследовании, а на одном из его экранов компьютера иллюстрируется зубчатая извилина в гиппокампе мыши, окрашенная методом Brainbow. Рисунок из статьи T.A. Weissman et al. Generating and imaging multicolor Braibow mice. Очень интересный и познавательный видеосюжет. Наверное, этот видеосюжет и подтолкнул меня написать данную заметку.
P.S. хорошая ссылка на Cre-LoxP рекомбинацию в интернете: old.abmgood.com/marketing/knowledge_base/Cre-Lox_Recombination.php
Источник: habr.com
К списку статей
Опубликовано: 28.06.2020 22:13:05
0

Сейчас читают

Комментариев (0)
Имя
Электронная почта

Биотехнологии

Brainbow

Cre-loxp

Мышь

Категории

Последние комментарии

© 2006-2020, personeltest.ru