В анонсах мероприятий, которые проходят в Leader-ID, можно встретить неожиданные вещи. К примеру мастер-класс по выделению молекул ДНК, для которого достаточно оборудования и реагентов, которые есть на любой кухне. Этот эксперимент можно провести вместе с детьми погрузить их, так сказать, в мир биологии и химии.

В основе поста рассказ Юлии Зайцевой, кандидата биологических наук факультета биологии и экологии Ярославского Демидовского университета (ЯрГУ). Если вам удобнее формат видео, оно тут.

Прежде чем мы начнем смешивать ингредиенты, буквально несколько слов про ДНК, ее структуру и роль в биологических процессах. А еще о том, как так вышло, что эту молекулу можно наблюдать невооруженным глазом. Если вы все это знаете, переходите сразу к пошаговой инструкции.

Структура ДНК

С химической точки зрения дезоксирибонуклеиновая кислота, или ДНК, это длинная полимерная молекула, состоящая из блоков, нуклеотидов.

Каждый нуклеотид включает:

• остаток фосфорной кислоты,

• сахар дезоксирибозу,

• и одно из четырех азотистых оснований.

Эти блоки в ДНК повторяются.

Азотистые основания это гетероциклические органические соединения, производные пиримидина и пурина. В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований. Для удобства их обозначают буквами:

• аденин (А),

• гуанин (Г),

• тимин (Т),

• цитозин (Ц).

Азотистые основания разных нуклеотидов соединяются между собой водородными связями согласно принципу комплементарности. Аденин образует связь с тимином.

А гуанин с цитозином.

В итоге молекула ДНК состоит из двух цепей нуклеотидов, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу.

Такая двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии.

Эту структуру ошибочно называют спиралью, но на самом деле это двойной винт.

Роль молекулы ДНК

С биологической точки зрения ДНК макромолекула, которая обеспечивает хранение, передачу и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов.

Биологическая информация в ДНК хранится в виде генетического кода, состоящего из последовательности четырех видов нуклеотидов. Так как различаются нуклеотиды только азотистыми основаниями, по основаниям их и называют:

Размер молекулы ДНК

Перейдем к математике посчитаем длину человеческой ДНК.

Общее число нуклеотидов в геноме человека 3,2 миллиарда. Линейная длина одного нуклеотида 0,34 нанометра. Перемножив эти показатели, получаем следующее:

Что суммарная длина молекул ДНК в одной клетке около двух метров (общая длина цепей в двухспиральной молекуле). При этом линейная длина самой клетки всего 30 мкм.

А размер ее ядра, в котором располагается молекула ДНК, еще в несколько раз меньше.

Как же два метра ДНК помещается в клетку, диаметр которой почти в 70 тысяч раз меньше?

За это отвечает механизм особой укладки ДНК в клетке, который называется компактизация. ДНК, как нить, накручивается на катушку из специальных белков гистонов. Катушки сближаются друг с другом, образуя структуру, напоминающую баранки на нитке. А потом эта нитка с баранками-катушками формирует сложные петли.

Если бы мы провели такую компактизацию в макромире, то смогли бы нитку длиной с Останкинскую башню (~500 метров) уложить в спичечный коробок.

Длина молекул ДНК в теле человека

В общей сложности в нашем теле ученые насчитывают около 70 триллионов клеток (своих и чужих тут мы не забываем про микробиом). Наименьшая длина молекулы ДНК 1,5 м.

Если умножить ее на количество клеток, получится, что общая длина цепочек ДНК в организме человека более 100 триллионов метров. Это грандиозная величина! Она чуть ли не в 1000 раз больше, чем расстояние от Земли до Солнца (150 млн километров).

Пошаговая инструкция по выделению молекул ДНК

Для эксперимента подойдет любой растительный материал. Проще работать с тем, что легче измельчить, например мякоть банана.

Чтобы извлечь ДНК из ядра растительной клетки, нам потребуются:

• ступка с пестиком, дома можно использовать блендер;

• воронка;

• стеклянная посуда: колба, стакан, пробирка или любая другая прозрачная емкость, которая найдется на вашей кухне;

• фильтровальная бумага или марля;

• хлорид натрия (поваренная соль) 1,5 г;

• гидрокарбонат натрия (сода) 5 г;

• весы, позволяющие взвешивать от одного до нескольких грамм; в отсутствие весов для соли и соды можно использовать мерные ложки здесь главное соблюсти пропорции ингредиентов;

• детергент (лат. detergio стираю) это разновидность поверхностно-активного вещества, которое уменьшает поверхностное натяжение воды и способствует ее проникновению в поры и между волокнами; детергенты помогают отмывать что угодно от грязи; в домашних условиях в качестве детергента можно использовать мыло, средство для посуды или шампунь;

• дистиллированная вода 120 мл;

• 95%-й этиловый спирт.

Шаг 1. Готовим буферный раствор

Буферными (англ. buff смягчать удар) называют растворы с определенной устойчивой концентрацией водородных ионов. Проще говоря, pH такого раствора почти не меняется, даже если мы добавляем в него кислоту или щелочь.

Чтобы приготовить буферный раствор для нашего эксперимента, наливаем в колбу 120 мл дистиллированной воды и добавляем в нее 1,5 грамма хлорида натрия. В домашних условиях можно использовать поваренную соль, это, конечно, не химически чистый NaCl, но для нашей миссии подойдет.

Далее взвешиваем и добавляем в раствор 5 грамм гидрокарбоната натрия (дома используем соду).

Если дома не нашлось инструментов для взвешивания 1,5 г соли и 5 г соды, можно приготовить больший объем буферного раствора с сохранением пропорции ингредиентов. В этом случае для последующих шагов берем только часть раствора.

После добавления перемешиваем содержимое колбы до полного растворения.

Шаг 2. Смешиваем буферный раствор с детергентом

В качестве детергента мы используем средство для мытья посуды. Нам будет вполне достаточно 5060 мл. Добавляем его в буфер и перемешиваем полученную смесь в течение трех минут.

Шаг 3. Подготовка сырья для извлечения ДНК

Мякоть банана тщательно измельчаем до однородного состояния. Дома это удобнее сделать блендером.

Шаг 4. Разрушение клеточных стенок

Полученную кашицу В смысле, к полученной массе добавляем холодную смесь буферного раствора с детергентом.

Тщательно перемешиваем.

Детергент разрушает клеточные мембраны и мембраны ядер клеток. Таким образом, нити ДНК окажутся свободно плавающими.

Шаг 5. Получение молекул в растворе

Разрушив клеточные стенки, удаляем их: для этого фильтруем раствор в течение 1015 минут при помощи воронки с фильтром. В нашем случае мы используем фильтровальную бумагу, но дома можно взять ткань или даже марлю.

Шаг 6. Визуализация

К полученному фильтрату по стенке сосуда под острым углом осторожно приливаем охлажденный в морозилке 95% этиловый спирт, чтобы он не перемешивался с содержимым. Добавляем сколько не жалко. Но в целом количества, равного половине имеющегося в колбе фильтрата, будет достаточно.

Предчувствуя вопрос из зала, скажу сразу нет, водка тут не подойдет.

И вот на границе раздела двух жидкостей мы наблюдаем, как постепенно появляются белые нити ДНК.

Из всех клеточных компонентов только ДНК быстро выпадает в осадок в спирте, образуя видимые глазу белые нити. Все остальные компоненты остаются в водной фазе.

Используя этот метод, можно выделить ДНК из любого растительного материала. На практике хорошие результаты получаются с луком, чесноком, бананами и томатами. В общем, дети будут довольны.

Недавно я рассматривал процессы которые используются для производства мРНК вакцин, и подумал, что будет уместным, написать еще и про производство векторных аденовирусных вакцин, таких как J&J, Oxford/AstraZeneca, CanSino, НИЦЭМ Гамалеи и других. Это совершенно другая система, со своими преимуществами и недостатками и со своей длинной историей масштабирования производства, где на каждом шагу - компромиссы. Всегда сложно вырваться из ограничений инженерной триады: "Быстро, Дешево, Качественно - выбирай любые два". Другими словами, если что-то выполняется дешево и качественно, то вряд-ли быстро или если быстро и качественно, то вряд-ли дешево. И, разумеется, если быстро и дешево, то навряд ли хоть сколь-нибудь качественно!

Дополнение: обзоры для дальнейшего чтения по этой теме можно найти здесь , здесь , здесь , здесь и здесь .

Введение: Аденовирусы и инфекции

Аденовирусы - это очень распространенные патогены, содержащие двухцепочечную ДНК и кажется бесспорным, что каждый читающий эти строки, заражался несколькими из них в течение жизни. Они, как правило, вызывают легкие респираторные симптомы и иногда проявляются в виде ушных инфекций или конъюнктивита. У нас нет никаких противовирусных препаратов или вакцин против аденовирусов в широком доступе (хотя были попытки программ разработок противоаденовирусных препаратов у военных). Подтипы: существуют как минимум 88 подтипов, которые способны заражать людей (больше с тех пор, как была опубликована эта статья!), подразделенных на несколько связанных групп. Среди наиболее распространенных аденовирус пятого подтипа (Ad5), и в некоторых регионах мира можно найти 80-90% населения уже серопозитивны.

Аденовирусы долгое время используются как инструменты в молекулярной биологии, потому что они способны переносить модифицированную ДНК, они не проявляют склонности интегрировать ДНК в человеческие геномы и умеют заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Но, как показывают вышеприведенные цифры, обратная сторона их использования в качестве терапии для людей, состоит в том, что у многих людей с самого начала могут быть антитела для борьбы с вирусным вектором, что, несомненно, снизит эффективность терапии. По этой причине ведется длительный поиск редких и необычных Ad-форм, что объясняет, почему J&J и НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи используют Ad26, Oxford / AZ использует вирус от шимпанзе (а не человеческий), ReiThera использует аденовирус гориллы и т.д. Собственно, поэтому люди задаются вопросом об общей эффективности CanSino, поскольку они используют Ad5 подтип.

Независимо от того, какой вариант вы используете, вам также нужно подумать, что произойдет если вы сделаете прививку вторую прививку той же вакциной - сколько вирионов дойдет до цели? Нужно отметить, что с текущим уровнем клинических испытаний, за короткое время, мы получаем все больше реальных данных - больше чем мы когда-либо могли себе представить. Такое положение дел тесно связано с еще большим вопросом: если вы получили вакцину (или даже генную терапию?) с определенным аденовирусным вектором, что произойдет, если вы захотите получить еще одну вакцину от другого заболевания, которая использует тот же вектор? Еще один неотвеченный вопрос - нужно ли исключать большое количество людей с Ad5, Ad26 и другим подтипами?

Независимо от типа аденовируса, конечный результат такой вакцинации очень похож на то, что происходит с мРНК-вакциной. Аденовирус внедряется и проходит свой обычный путь инфицирования - вся машинерия остается неизменной. Но в этом случае, ДНК, которая доставляется в ваши клетки - не большой набор инструкций, для создания новых аденовирусов, а гораздо более короткие последовательности которые кодируют белок-шип коронавируса. Другими словами, модифицированная ДНК транскрибируется в информационную РНК в ваших клетках (это тот же самый шаг, с которого начинают мРНК вакцины), и далее мРНК транслируется рибосомой в тот самый белок-шип. Производство этого чужеродного белка запускает иммунную систему, которая безусловно, уже наготове, потому что уже заметило вирусную атаку. Вот почему вам не нужно добавлять адъювант ни к вирусным векторным вакцинам, ни к мРНК вакцинам - они прекрасно запускают различные механизмы обнаружения чужеродных ДНК и РНК сами по себе, в то время, как просто инъекция белка шипа пропускает некоторые механизмы обнаружения. Как правило, такие системы основаны на обнаружении чужеродных ДНК и РНК, и переход от них к введенному белку приводит к менее энергичному ответу (поэтому нужен адъювант).

Создание аденовирусного вектора

Итак, перейдем к тому, как делать вакцины. Вам нужно будет произвести огромное количество инфекционных вирусных частиц, каждая из которых содержит модифицированную укороченную ДНК, которую вы хотите доставить в клетки пациента. Вы особенно хотите вырезать часть аденовирусного генома, которая называется E1, удаление которого делает невозможным репликацию вируса. Если вам нужно больше места, вы также можете вырезать часть, которая называется E3. Все это было исследовано некоторое количество лет назад - как оказалось в вирусном геноме есть ряд областей, которые подходят для сплайсинга в ваших собственных последовательностях.

Но для того, чтобы сделать задуманное и создать систему, которая будет производить заготовки нового вирусного вектора, потребуется несколько генетических шагов. Наиболее распространенный способ это сделать, если в общих чертах - создать связку (линейной) аденовирусной ДНК, с вашими собственными модификациями, а затем поместить ее в большой реактор, заполненной культурой человеческих клеток. И (это важно) эти человеческие клетки специально сконструированы для производства белков, которые оригинально должна производить вирусная E1 область, то есть, та область, которая отвечает за репликацию. Этот трюк позволяет модифицированному аденовирусу реплицироваться в культуре клеток человека и дает значительный выход новых вирусных частиц, но гарантирует то, что полученные вирусы сами не смогут больше реплицироваться. Белки E1, которые им нужны, не закодированы в их геномах (вы вынули эту часть), но присутствовали в культуре человеческих клеток. При введении пациенту они определенно не встретят никаких других человеческих клеток, которые вырабатывали бы для них вирусные белки E1.

Итак, первый шаг в процессе - создание вирусной ДНК и изготовлении большого количества ее. Этот процесс часто выполняют в бактериях, потому что бактериальная ДНК относительно проста в обращении и репликации. На самом деле, есть коммерческие системы, которые можно купить, чтобы сделать нужное в лабораторных масштабах - то есть , вы можете купить плазмиды (кольцевые молекулы ДНК, используемые бактериями) которые уже имеют A5 аденовирусный геном, с уже удаленными E1 и E2 областями, с дополнительными последовательностями, настроенными для простой вставки любой ДНК. Еще один способ сделать требуемое - использовать плазмиду, которая называют искусственная бактериальная хромосома (bacterial artificial chromosome, BAC), вы можете купить такие варианты, у которых есть функции, необходимые для модификации. Но помните, что J&J и НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи используют Ad26, в то время как Oxford/AZ используют аденовирус шимпанзе, поэтому коммерческие Ad5 реагенты бесполезны - упомянутые компании разрабатывают свои собственные инструменты. Ранее CanSino сообщила об использовании коммерческой системы AdMax от Microbix (Toronto) для своей работы с плазмидами. Как бы то ни было, в любом варианте, сначала нужно заставить бактерии (часто это старая добрая кишечная палочка), наработать большое количество копий плазмид. Потом вы лизируете (вскрываете) бактерии, изолируете нужные ДНК, а затем раскрываете кольцевые плазмиды, чтобы получить линейные молекулы ДНК. Некоторые из BAC могут быть спроектированы так, чтобы делать и эти модификации за вас, экономя вам один шаг. Линейная форма ДНК нужна для репликации/упаковки аденовируса, когда он находится в клетке, но также можно получить ДНК аденовируса в виде кольцевой плазмиды. Ранние оксфордские статьи ссылаются на эту главу книги о своих методах. Что касается J&J, то в этом патенте есть некоторые детали их системы.

Судя по этой и этой статье, видно , что команда Oxford / AZ использует BAC, сконструированный из комбинации двух различных плазмид через рекомбинирование, чтобы внедрить их в то что раньше было областью E1 аденовирусного сиквенса. (Я опускаю детали этого процесса, чтобы сэкономить время, место и ваше терпение). Между тем, вы можете прочитать о том, что представляет собой плазмидная система J&J здесь и здесь (последняя ссылка подробно описывает другой подтип аденовируса, но очевидно про аналогичные методы, используемые для Ad26).

Пришло время внедрить эти линейные молекулы ДНК в культуру человеческих клеток. Тут может наблюдаться некоторое противоречие, в зависимости от ваших убеждений. Похоже, что Oxford/AZ, Гамалея и CanSino используют для этого процесса модифицированную версию клеток HEK293, а J&J использует линию под названием PER.C6. Два этих варианта известны уже некоторое время. Аббревиатура HEK обозначает эмбриональную почку человека (human embryonic kidney, HEK), и действительно, она была впервые выделена из ткани абортированной плода в начале 1970-х годов в Лейденском университете. Клеточную линию PER.C6 начали использовать к 1998 году, но получили ее в 1985 году также в Лейдене, и также из абортированной ткани, причем часть ER означает эмбриональные ретинобласты. Как вы прекрасно понимаете, люди с сильным предубеждениями против абортов без энтузиазма воспринимают подробности происхождения данных вакцин, в то время как людей с другими убеждениями эта история не беспокоит. Тем не менее, несмотря ни на что, особенно важно, чтобы линейная ДНК трансфектировалась в какую-либо культуру комплементарных человеческих клеток - это единственный способ получить повышенный выход конечных вирусных частиц, пригодных для использования в вакцине.

Читая о производстве векторных вакцин, вы иногда можете встретить фразы "резерв вирусного семенного материала" (virus seed stock) и банк клеток-хозяев (host cell bank). Ниже вы увидите, что по всему миру существуют производственные площадки для вакцин, и последнее, что вам нужно, - это чтобы все работали в одиночку. Партии плазмид, линейных ДНК, комплементарных клеток и конечного аденовируса хранятся для дальнейшего использования и/или распространения и исчерпывающе охарактеризованы. Вы определенно хотите внимательно следить за партиями, чтобы быть уверенными, что вы имеете дело с одними и теми же вещами на всех производственных площадках.

Культура клеток человека - любая культура клеток - одновременно и научный процесс, и искусство. Спросите любого, буквально любого, кто работал в этой области, особенно в промышленном масштабе, то они подтвердят это с еще энергичнее. Это (возможно) самое слабое место всего процесса производства вирусных векторов. Когда все хорошо работает, сложно превзойти данный метод заражения живых клеток и превращение в фабрики вирусов. Но не всегда все работает так, как должно. Похоже, что у AstraZeneca возникли проблемы, из-за того, что на одном из их крупнейших производственных предприятий возникли проблемы с низким выходом вируса, хотя все должно быть одинаковым (та же вирусная ДНК, та же линия клеток и т.д.)

Чтобы представить культуру клеток HEK293, необходимо знать, что они бывают разных типов, те, которые растут на поверхности культурального сосуда (прикрепленные, HEK293A) или те, которые растут плавая в суспензии (HKE293S). Возможно, вам понадобится последний вариант для серьезного масштабирования (не в последнюю очередь потому, что так можно выращивать в трех измерениях а не в двух), но и это можно сделать любым способом. Прикрепленные клетки растут до тех пор пока не соприкасаются и не образуют пластовый слой на своей поверхности, и некоторые линии клеток в этом случае развиваются нормально, а другие, случается, нет (или постепенно менее "счастливы" из-за соседства). Линии суспензионных клеток делятся и образуют более концентрированную суспензию, и также по-разному реагируют на этот процесс. Вы должны продумать, в каких средах все эти клетки растут и какие питательные вещества необходимо предоставить (и в какой концентрации), накоплении отходов (и остатков мертвых клеток), промывании прикрепленных линий свежей средой, скорости перемешивания, технике суспендирования ... о, это бесподобно.

Например, когда используются искусственно созданные клетки для производства модифицированных человеческих белков (чрезвычайно распространенная задача как в академической, так и в промышленной молекулярной биологии), я участвовал в проекте, в котором выход белка резко менялся с использованием тех же зачарованных клеток, выращенных в "барабанах", которые перемешивались путем медленного вращения (примерно как в хот-дог-аппаратах), по сравнению с "шейкерами", более свободного типа, которая медленно раскачивалась вращательными движениями. Почему это важно для клеток? Лучше вы мне это расскажите - но при одних условиях клетки производили намного больше белка, чем при других. Почему одна из фабрик у Астразенеки производит меньше векторных вирусов, чем должна? Кто знает?

Очистка и упаковка

Выделение вирусных частиц, вероятно, устроена очень похожим образом у всех обсуждаемых вакцинах. Мне не удалось (что неудивительно) найти подробную информацию о производстве какой-либо из текущих вакцин, но, вероятно, этот этап был одним из менее сложных частей оптимизации процесса, учитывая всю работу, которая уже была проделана над аденовирусами в течение многих лет. Вы лизируете клетки культур и делаете грубую фильтрацию, чтобы пропустить вирусные частицы и удержать клеточный мусор. Согласно этой странице от AstraZeneca, похоже, что они несколько этапов фильтрации, а затем используют мембранную хроматографию (вероятно, используют какой-то варианта ионообменной технологии, разделения по заряженным остаткам поверхностных белков вируса) с последующей ультрафильтрацией. Можно поспорить, что все обсуждаемые компании уже имели довольно четкое представление о том, какие именно шаги они собираются предпринять, даже если все эти шаги требовали некоторой настройки оптимизаций, а также верификации на каждом шаге. Соответствующие регуляторы, знают об этих деталях, но я не думаю, что мы увидим эти детали.

Далее необходимо сформулировать вирусные частицы, что является гораздо менее сложным процессом, чем в случае с вакцинами мРНК. Остальные ингредиенты для вакцины достаточно безобидны, никаких необычных липидов, необходимых для липидных наночастиц. Вот список вакцины от НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи (см. первую страницу текста); в нем нет ничего, что могло бы вызвать проблемы с поставками. Наконец, время для "разлива/финализации", что является общим шагом для всех - увеличение мощностей производственных линий по наполнению и закупориванию стерильных флаконов.

Итак, теперь вы знаете про весь процесс, по крайней мере в общих чертах. Любой из этих этапов можно рассматривать детальнее, но по большей части текст должен дать вам базовое представление о том, что происходит (а во многих случаях, дает вам даже больше, чем вы когда-либо хотели знать!). Как видите, это принципиально иной процесс, нежели производство вакцины мРНК, со своей спецификой (хорошей и плохой). Все это может стать важным, если нам придется переоборудовать существующие вакцины-кандидаты для новых вариантов, но эта тема для другого дня!