Год назад я побывала на курсе Mouse genetics; models for human
diseases, проводимом International Centre for Genetic Engineering
and Biotechnology (ICGEB). За этой организацией я наблюдаю уже
давно (с 2014 года) и, когда выпадает такая возможность, приезжаю к
ним на конференции и воркшопы. На данный момент ICGEB охватывает 98
стран, из которых 65 являются членами организации. Украина, к
сожалению, пока еще не является страной-участницей, но около 2-х
лет назад был подписан договор о коллаборантстве с ICGEB.
Сотрудничество государств с ICGEB сулит исследователям огромные
перспективы, к примеру, возможность выполнить научную работу в
сердце организации Триест (Италия) или принять грантовое участие в
курсах, конференциях. Магистрам и диссертантам государств-участниц
предоставляется возможность проводить исследования на новейшем
оборудовании. Для Украины это жизненно важный фактор, поэтому я с
нетерпением жду, когда же подписанный между Послом Украины в Италии
Евгением Перелыгиным и ICGEB договор вступит в силу. Замечу, что
для ученых из стран, не являющихся коллаборантами организации,
двери также открыты. Но регистрационный взнос в этом случае
придется платить самостоятельно.
Вернусь к рассказу о прошлогоднем курсе. Я чрезмерно радовалась
возможности поучаствовать с докладом The mouse rodent model (root
vole, Microtus oeconomus Pall.) in the ecotoxity bioindication.
Конечно, моя тема далеко не во всех аспектах могла соревноваться с
инновационными разработками, привезенными другими участники курса.
А доклады сотрудников лабораторий ICGEB вообще были выше всяких
похвал! Однако модельные животные это все-таки моя тема: как-никак,
я проработала 4 года в Институте молекулярной биологии и генетики,
моделируя всевозможные заболевания на мелких грызунах. А также у
нас была GFP мышь, которая тоже используется как модельное
животное. Поэтому я, опьянев от восторга, сидела и завороженно
слушала докладчиков.
Должна заметить, что ранее я даже не подозревала о существовании в
Германии German Mouse Clinic. Dr. Wolfgang Wurst в простой и
доступной форме рассказал о секретах создания линий трансгенных
животных-моделей с разными (зависящими от воли экспериментатора)
генами человека. Ученый объяснил, сколь важно после получения
первой генерации трансгенных животных ответственно отнестись к
разведению полученных особей по соответствующим зоотехническим
принципам, наращивания поголовье с постоянным контролем наличия у
полученного потомства генов человека. Примерами контроля могут
послужить, в том числе, обычные визуальные характеристики, к
примеру, изменение шерсти животного, размера хвоста, средних
размеров и т. д. К примеру, если мы моделируем гомозиготную особь
по гену MSTN, то мышь будет значительно крупнее, чем представитель
дикого типа). Также в его клинике для мышей используют аппарат УЗД
и рентгеновских снимков. К примеру, болезнь Педжета характеризуется
нарушением костного ремоделирования, что приводит к увеличению и
деформации костей. На рентгене будет видны характерные изменения.
Эта болезнь обусловлена мутацией в генах SQSTM1 и RANK. Доктор
Вольфгант Вурст также упомянул, как об эталоне, о модели
Brainbow.
Модель Brainbow направлена на картирование взаимосвязей нейронов
головного мозга. Для того, чтобы создать такую модель, надо
нокаутировать те гены, которые интересует биотехнолога с помощью
так называемого инструмента Cre-LoxP системы. Состоит эта система
из Cre-рекомбиназы и LoxP-сайтов (последовательность ДНК, состоящая
из 34 пар нуклеотидов). Эта система была подсмотрена и
позаимствована у природы, а именно у фага Р1. У фага Р1 эта система
позволяет осуществлять нормальный жизненный цикл этого вируса со
встройкой фага в геном бактерий. В эксперименте ученые вводят
кассету с генами 4 флуоресцентных белков и между генами шесть
LoxP-сайта (3 пары: 1, 2 и 3) таким образом, чтобы пары были
направлены в одну сторону. Такой способ введения LoxP-сайтов
обеспечивает вырезание участка, находящегося между идентичными
LoxP-сайтами. Обеспечивает это фермент Cre-рекомбиназа. Итак,
фермент Cre-рекомбиназа сворачивает молекулу ДНК таким образом,
чтобы выстроить идентичные LoxP-сайты друг напротив друга, и
производит перекрест между этими участками молекулы ДНК. Приводит
это к тому, что участок, который находился между двумя
LoxP-сайтами, оказывается заключен в петлю и в последующем вырезан
из молекулы. Участки, которые были справа и слева от LoxP-сайтов,
соединяются вместе. Поэтому такую систему называют нокаут так как
она выключает определенные гены. Но модель Brainbow это не просто
нокаут, а Conditional Knockout, то есть нокаут при определенных
условиях. Для этого Cre-рекомбиназа активируется только в клетках
гиппокампа. Чтобы Cre-рекомбиназа запускалась только в конкретных
клетках, выбирают специальный промотор, в данном случае промотор
гена THY1. В этой конструкции сразу четыре части, которые кодируют
флуоресцентные белки: оранжевый, красный, желтый и синий. Если
рекомбинация пройдет по сайтам первой пары, то из конструкции
удалится оранжевый флуоресцентный белок, а с промотором соединится
красный флуоресцентный белок. Если рекомбинация произойдет по
сайтам второй пары, то удалится оранжевый и красный флуоресцентный
белки, а промотор соединится с желтым. Ну и третий вариант удалится
оранжевый, красный и желтый, а останется только синий. Это приводит
к тому, что каждая клетка окрашивается в свой цвет. Из-за
комбинаций различных флуорохромов и цветов можно достичь около 70
отдельных цветовых комбинаций, которые различимы компьютером.
Из таких клеток, где произошла успешная гомологичная рекомбинация,
можно получить трансгенных животных. При скрещивании с линией
мышей, имеющих ген Cre-рекомбиназы, получалось потомство, несущее и
ген Cre-рекомбиназы, и многоцветную кассету. У таких мышей
произойдет рекомбинация и нейроны будут окрашены, ученым несложно
будет проследить, где начинаются и заканчиваются отростки нервных
клеток, а, следовательно, можно отслеживать взаимосвязи нейронов
головного мозга.
Модель Brainbow действительно можно назвать эталоном. Она очень
изящная. Кстати, на этой неделе пролистывала новости института
Богомольца и увидела видео Медэкспертиза 5 канал. Ролик посвящен
вопросам изучения процессов боли, ощущений ее интенсивности и
преодоления без аналгетиков. Аспирант института физиологии НАН
Украины Ярослав Андрианов рассказывает о своем исследовании, а на
одном из его экранов компьютера иллюстрируется зубчатая извилина в
гиппокампе мыши, окрашенная методом Brainbow. Рисунок из статьи
T.A. Weissman et al. Generating and imaging multicolor Braibow
mice. Очень интересный и познавательный видеосюжет. Наверное, этот
видеосюжет и подтолкнул меня написать данную заметку.
P.S. хорошая ссылка на Cre-LoxP рекомбинацию в интернете:
old.abmgood.com/marketing/knowledge_base/Cre-Lox_Recombination.php