Измерение температуры

Привет, Хабр! Представляю вашему вниманию перевод и адаптацию оригинальных технических статей по тематике применение телевизоров для температурного скрининга человека: ELEVATED BODY TEMPERATURE (EBT) FUNDAMENTALS и BEST PRACTICES FOR EBT.

Цель этой статьи помочь читателю избежать простых ошибок, которые совершают многие организации, спеша внедрить технологию тепловидения для скрининга повышенной температуры. Это далеко не всеобъемлющий документ, но его цель дать общее представление о том, насколько эффективно использовать тепловизионную технологию для данной цели.
Статья предназначена в первую очередь для технических специалистов, которые заинтересованы глубже разобраться в теории данного вопроса.

Глобальное распространение нового коронавируса (COVID-19) меняет нашу жизнь и попадает в заголовки новостей по всему миру. Спрос на тепловизионные камеры для выявления повышенной температуры тела (Elevated Body Temperatures, EBT) существенно вырос в последние месяцы. Технология внедряется в аэропортах, на предприятиях и в других общественных местах в поисках признаков лихорадки в качестве показателя заболевания.

Многие тепловизионные камеры, которые в настоящее время широко используются для скрининга на лихорадку, не подходят для этого применения. В этой статье мы попытаемся охватить факты и некоторые важные моменты, которые необходимо учитывать, если вы или ваша организация хотите инвестировать в эту технологию.

Тепловидение дополнительно может обеспечить измерение температуры поверхности тела человека. Оно было эффективно применено для задач температурного скрининга и, вероятно, гораздо более эффективно, чем многие другие бесконтактные устройства измерения температуры. Однако у этой технологии есть свои ограничения. Это ограничения, которые действуют для всех устройств с тепловым приемником излучения (болометры) и применительны ко всем маркам / моделям / брендам также как к большинству ручных термопушек и бесконтактных термометров.

В открытом доступе присутствует очень много дезинформации. В Интернете и в новостях появляется множество видеороликов, посвященных скринингу лихорадки с использованием тепловизионных камер. Они часто показывают камеру, смотрящую на большое количество людей, проходящих через поле зрения камеры. Эти системы не обеспечивают эффективное сканирование и дают ложное представление о том, как может использоваться тепловизор. В лучшем случае этот подход может выделить людей с повышенной температурой поверхности кожи, что не обязательно является хорошим показателем повышенной температуры тела. Такие факторы, как, если человек потеет, носит косметику или двигается, может полностью нарушить измерения температуры поверхности кожи.

После вспышек атипичной пневмонии и других инфекционных заболеваний были разработаны международные стандарты скрининга на лихорадку с использованием термографии. Если вы планируете использовать эту технологию для данного применения в своем бизнесе, данные стандарты должны приниматься во внимание при разработке методологии тестирования даже если вы не можете следовать этим стандартам. На сегодняшний день уже установлено много скрининговых систем, которые совершенно неэффективны и приведут к ложному ощущению безопасности внутри организации.

IEC 80601-2-59:2017

Изделия медицинские электрические. Часть 2-59. Частные требования безопасности с учетом основных функциональных характеристик к скрининговым термографам для скрининга повышенной температуры у человека.
(оригинал: Medical electrical equipment Part 2-59: Particular requirements for the basic safety and essential performance of screening thermographs for human febrile temperature screening).

ISO/TR 13154:2017

Электрооборудование медицинское. Установка, применение и руководство по эксплуатации скрининговых термографов для определения фебрильной температуры человека.

(оригинал: Medical electrical equipment Deployment, implementation and operational guidelines for identifying febrile humans using a screening thermograph).

Некоторые из основных моментов:

• Чтобы получить наиболее близкое представление о внутренней температуре тела, проводится измерение в области внутреннего угла глаза (глазная щель или кантус, англ. canthus). Кантус, как известно, обеспечивает приемлемое показание температуры тела.
• С точки зрения термографии, для получения точных измерений вам потребуется около 4х4 пикселей, покрывающих кантус. Как правило, для камеры с разрешением 320x240 лицо человека должно занимать >75% ширины изображения, чтобы обеспечить достаточную плотность пикселей для точного измерения.
• Камера должна смотреть прямо в лицо.
• Головные уборы, очки, солнцезащитные очки и т. д. должны быть удалены, чтобы глаза были хорошо видны.
• Контрольное черное тело должно находиться рамках обзора камеры на том же расстоянии от камеры, что и лицо, так чтобы и лицо/глаза и контрольная панель черного тела находились в фокусе одновременно.

Этими факторами можно управлять на стойках проверки паспортов или турникетах. Однако, их гораздо сложнее контролировать в открытом пространстве.

Примечания по выбору камеры

Сейчас на рынке присутствует много оппортунистического маркетинга. Многие продавцы продвигают камеры для температурного скрининга, которые принципиально не подходят для данной цели. Помните, что с любой камерой любого производителя маркетинг не изменит физику! Как и программное обеспечение или ИИ (прим. Искусственный Интеллект). Любой, кто утверждает обратное, должен быть тщательно проанализирован и проверен фактами авторитетными организациями, такими как профессиональные ассоциации термографии. Камеры, используемые для тепловидения, построены с иным набором проектных целей в отличии от камер, созданных для термографии, то есть радиометрически откалиброванных тепловизионных камер, которые предназначены для измерения температуры, а не просто для получения теплового изображения.

Давайте пройдемся по основам термографии!

Мгновенное поле обзора (instantaneous field of view, iFoV) камеры это размер одного пикселя на заданном расстоянии от камеры. Значение поля обзора (measurement field of view, mFoV) камеры обычно составляет около 4 iFoV, то есть 4 4 пикселя. Это самый маленький объект, температуру которого может точно измерить камера. Горячий объект меньшего размера будет определяться более холодным, чем его фактическая температура.

Обратите внимание, что mFoV = 4 x iFov требование для тепловой камеры, которая имеет отличную оптику. Но большинство тепловизоров не имеют отличной оптики.

• Точная фокусировка объектива на объекте важна для получения точных показаний температуры. Многие камеры, предназначенные для приложений безопасности, или недорогие камеры, предназначенные для термографии, имеют конструкцию без фокусировки. Это фантастика для простоты использования камеры. Тем не менее, для возможности работы без фокусировки, должны быть достигнуты компромиссы в оптической конструкции. Например, объективы без фокусировки обеспечивают большую глубину резкости, так что объекты, находящиеся близко к камере и на большом расстоянии, могут одновременно находиться в приемлемом (но не отличном примеч. переводчика) фокусе. Это может потребовать увеличения f-числа или аналогичных технологических изменений, ухудшающих качество изображения, которое может быть получено. Короче говоря, тепловизионная камера, в которой нет объектива с регулируемой фокусировкой, вероятно, не подходит для задач термографического скрининга.
• Производственные допуски не контролируются жестко на многих устройствах. Это приводит к изменению оптических свойств, которые инженер-оптик намеревался использовать в процессе проектирования, а также к дополнительным различиям между каждой производимой линзой. Это часто сочетается со слабыми стандартами обеспечения качества и калибровки. Линза, которая создает приемлемое для глаза изображение, может быть идеально подходящей для приложений безопасности, но если она не соответствует строгим проектным параметрам, то она, вероятно, не подходит для приложений измерения температуры.
• Длинноволновые инфракрасные (Longwave Infrared, LWIR) тепловизионные линзы традиционно изготавливались из германия с высококачественными антиотражающими покрытиями. Германий является дорогим сырьем, а затраты на обработку высоки. Применение тепловидения в индустрии безопасности привело к резкому падению цен на тепловизоры. В основном это произошло в результате перехода от германиевых линз к линзам, изготовленным из халькогенида или других подобных материалов, которые могут быть произведены серийно при гораздо меньших затратах. Эти материалы часто не преломляют длинноволновое инфракрасное излучение также, как германий, а это означает, что может быть больше дисперсии между длинами волн 7 мкм и 14 мкм, к которым чувствителен микроболометр. Это может привести к размытой (soft примеч. переводчика) фокусировке изображения. Влияние с точки зрения термографии состоит в том, что требование к mFoV может стать 5 x iFoV или больше (что приведет к тому, что лицо человека должно уже занимать не 75%, а 90% ширины изображения, чтобы обеспечить достаточную плотность пикселей для точного измерения температуры примеч. переводчика).

Теперь давайте обсудим применение

Разрешение камеры

Во-первых, давайте предположим, что глазная щель (или кантус) это целевая зона (hot spot), которую мы должны измерить. Размер кантуса не более 3 мм в поперечнике. Тогда давайте предположим, что наша камера имеет абсолютно идеальную оптику, и нам нужно mFoV 3x3 пикселей для точного измерения температуры. Это дает нам iFoV 1 х 1 мм, то есть каждый пиксель это квадрат 1 мм в высоту и 1 мм в ширину на расстоянии от измеряемого лица.

Поскольку mFoV не подлежит обсуждению, это означает, что поле обзора камеры будет меняться в зависимости от ее разрешения, например:

• Камера с разрешением 640x480 может иметь поле обзора не более 640 мм (по горизонтали) и 480 мм (по вертикали).
• Камера с разрешением 320x240 может иметь поле обзора не более 320 мм (по горизонтали) на 240 мм (по вертикали).
• Камера с разрешением 256x192 может иметь поле обзора не более 256 мм (по горизонтали) на 192 мм (по вертикали).
• И т.д.

Имейте в виду, что вышеизложенное является наилучшим сценарием, предполагающим абсолютно совершенную оптику, чего не будет в реальном мире. Это причина того, что точный скрининг нескольких людей по всей комнате просто невозможен, независимо от от того, что обещают продавцы-шарлатаны. Как минимум, следует использовать камеру с разрешением 320х240 и фокусируемой оптикой. Лицо тестируемого должно заполнять большую часть поля зрения камеры.

Это согласуется с утверждениями, скрытыми глубоко в руководстве пользователя для таких камер как FLIR A320 Tempscreen (FLIR один из наиболее авторитетных производителей тепловизионных камер в мире примеч. переводчика), в котором говорится, что расстояние до лица должно быть подобрано таким образом, чтобы лицо занимало более 75% ширины изображения, даже если это не отображено во многих видео и фотографиях этих камер при использовании.

Точность измерения камеры

Те же самые правила, которые применяются к традиционному применению термографии, применяются к скринингу лихорадки. Очень просто ввести в камеру неправильные значения коэффициента излучения или другие настраиваемые параметры. Это заставит камеру возвращать абсолютные бессмысленные результаты измерения температуры. Существует много информации, которая объясняет основы термографии.

Если сфокусироваться на скрининге лихорадки, то используются два подхода к измерению температуры, каждый из которых по-разному учитывает погрешность в точности измерения камеры:

• Абсолютный температурный порог. Например, обнаружено значение >37,4C
• Метод скользящего среднего. Например, температура индивидуума на 1C выше, чем в среднем за последние 10 человек, прошедших скрининг

Оба подхода имеют разные требования к камере и конфигурации, которые обсуждаются отдельно ниже.

Метод абсолютного температурного порога

У большинства тепловизионных камер абсолютная точность измерения определяется как что-то вроде более 2C / 2% от показаний. Когда мы говорим о допустимой погрешности около 1C для задач выявления повышенной температуры, то такой точности уже недостаточно. Чтобы все же использовать эти камеры, мы можем разместить эталонную панель черного тела в поле зрения камеры. Это черное тело почти идеальный источник тепловой энергии, температуру которого камера может очень точно измерять.

Фокус камеры важен для точности измерения температуры. Важно убедиться, что черное тело находится на том же расстоянии от камеры, что и лицо обследуемого индивидуума. Это гарантирует, что и лицо, и черное тело могут быть в резком фокусе одновременно. Также важно, чтобы эталонная панель черного тела была достаточно большой, чтобы камера могла очень точно измерить, в качестве минимального ориентира следует использовать размер панели, превышающий 10x10 пикселей. Измеренная температура черного тела может затем использоваться для обеспечения коррекции температуры на камере. Если этот подход будет принят, то точность измерения камеры будет порядка 5x-10x спецификации NETD.

Тепловая чувствительность или шумовая эквивалентная разность температур (NETD Noise Equivalent Temperature Difference) описывает наименьшую разницу температур, которую вы можете видеть с помощью камеры. Чем меньше число, тем лучше тепловая чувствительность инфракрасной системы.

Тепловые камеры, разработанные для систем безопасности, часто имеют NETD до 150 мК. Для задач температурного скрининга значение NETD камеры должно быть не более 50 мК. Даже если камера с 100 мК NETD используется с эталонной панелью черного тела, погрешность измерения будет около 10x100 мК = 1C, и это, не считая любых возможных изменений в самом черном теле. Это не подходит для применений в скрининге. Стоит также отметить, что производители оборудования делают эти расчеты по-разному. Камеры от дешевых производителей могут скрывать плохую чувствительность, делая замеры NETD при 50C вместо отраслевого стандарта 30C.

Есть и другие моменты, которые должны быть учтены.

• Линейность по детектору важна. Термографические камеры делают самокоррекцию с помощью затвора с коррекцией неоднородности (NUC non-uniformity correction).

Камеры, разработанные для приложений безопасности, сводят к минимуму количество циклов NUC, поскольку это заставляет изображение зависать на несколько секунд каждый раз, когда это происходит, что не идеально, если в этот момент какие-то плохие парни пробираются мимо охраны. Однако для приложений измерения температуры важно, чтобы циклы NUC выполнялись регулярно для оптимизации линейности изображения и минимизации дрейфа измерения во времени.

Если температура черного тела отслеживается между циклами NUC, то во время измерения будет наблюдаться некоторый дрейф, что приведет к пилообразной схеме измерения температуры. При использовании высококачественной термографической камеры пиковое изменение этого пилообразного сигнала будет <0,1C. С камерой, которая предназначена для задач безопасности с добавленной функцией радиометрии, дрейф датчика от пика к пику с течением времени может составлять >1C. Это не подходит для задач скрининга, где стабильность показаний имеет решающее значение.

Пока термографическая камера какое-то время нагревается до устойчивой рабочей температуры, она будет проводить коррекцию неоднородности чаще, поэтому рекомендуется, чтобы для задач температурного скрининга камера в течение примерно 30 минут нагрелась (поработала вхолостую прим. переводчика), прежде чем начнется сам скрининг.

• Оптические артефакты, такие как виньетирование, могут привести к тому, что температура на краю рамки будет отличаться от температурных измерений в центре рамки. Оптика тепловизионных камер хорошего качества должна минимизировать это, но камеры, предназначенные для задач, где некоторое виньетирование не имеет значения (например, камеры безопасности), часто имеют очень плохие оптические артефакты и могут иметь погрешности в измерениях >2C между центром изображения и углами изображения. Это может быть проблемой, если черное тело расположено на краю кадра, а лицо в центре.

В последние недели на рынке появилось множество тепловизионных систем, ориентированных на скрининг COVID-19. Многие из этих камер имеют чрезвычайно высокую точность, указанную в их технических характеристиках, например, 0,1C. Эти типы утверждений вызывают тревогу у большинства профессиональных термографистов.

Некоторые производители аргументируют такую точность заявлениями, что они используют NETD камеры в качестве точности в тех случаях, когда в кадре присутствует контрольная панель черного тела. Это неправильно по нескольким причинам. Например, NETD рассчитывается с использованием среднего значения всех пикселей и может не быть репрезентативным для какого-либо отдельно взятого пикселя, включая пиксели, которые расположены в кадре вне измеряемой зоны. Это также предполагает, что черное тело обладает идеальной стабильностью и не имеет температурной неопределенности, что является невозможным в реальном мире.

Это подчеркивает, что существуют существенные различия в способах, которыми производители рассчитывают технические характеристики, представленные в их даташитах. Калибровка тепловизионной камеры сложный процесс. Эта статья объясняет некоторые тонкости более подробно.

Стоит подчеркнуть, что калибровка камеры зависит и от температуры окружающей среды, и от температуры датчика, и оптики. Высококачественные термографические камеры калибруются во всем диапазоне рабочих температур, чтобы гарантировать, что калибровка действительна при любых условиях эксплуатации. Многие камеры не калибруются и будут калиброваться только при одной рабочей температуре. В сертификате калибровки, прилагаемом к вашей камере, должны быть указаны условия тестирования и известные ограничения для калибровки. Он должен ссылаться на существующие стандарты (NIST и т. д.) для любых источников излучения, используемых при калибровке.

IEC 80601-2-59 содержит очень четкие указания относительно того, как должна оцениваться и проверяться точность. Поставщик системы должен иметь возможность предоставить руководство по этому вопросу.

Технические характеристики камеры:

• IR resolution: 640 480 pixels
• Thermal sensitivity/NETD: < 0.03C @ +30C / 30 mK
• Field of view (FOV): 25 19 (31 diagonal)
• Spatial resolution (IFOV): 0.68 mrad
• Object temperature range: 40C to +150C
• Accuracy: 2C or 2% of reading

Технические характеристики черного тела:

• Target Temperature: 35 C
• Emissivity (): 0.98 0.004 (for wavelength of 8 to 14 m)
• Aperture diameter: 80 mm
• Temperature uncertainty: 0.4 C for T(ambient) = 10 to 30 C
• Repeatability: 0.2 C
• Stability: 0.1 C
• Temperature uniformity: 0.2 C

Как настраивается система скрининга для данной спецификации:

• Мы устанавливаем камеру на уровне головы и отмечаем пол, где люди могут стоять на расстоянии 1,4 м от камеры. Это дает нам mFoV 2,9 мм и горизонтальное поле зрения шириной 61 см с заявленной линзой.
• Мы устанавливаем черное тело на подставку рядом с тем местом, где лицо человека будет на расстоянии 1,4 м от камеры. Черное тело направлено прямо на камеру.
• Место измерения в настройках камеры устанавливается в центре эталонной панели черного тела и настраиваются соответствующие локальные параметры (излучательная способность, расстояние и т. д.).
• Настраивается область измерения, охватывающая требуемую зону лица.
• Людей просят подойти к месту проверки один за другим, снять головные уборы, очки и т. п., а затем стоять на месте во время захвата изображения. Это происходит быстро, потребуется меньше секунды.
• Человек должен смотреть прямо в камеру, а не смотреть вверх, вниз или в сторону.
• Коэффициент излучения установлен на 0,98, расстояние до цели и параметры окружающей среды установлены правильно.
• Как в целевой области лица, так и в целевой области черного тела должны быть заданы правильные параметры индивидуально.
• Логика камеры затем настраивается примерно так:
  
  • T = T (Площадь Макс.) T (Точечный)
  • Тревога, если T > 2,4 C

Это вызовет тревогу, если показатель температуры любого человека будет выше 37,4C. Температура 37,5C в зоне кантуса обычно рекомендуется как хорошая отправная точка для начала скрининга на возможное наличие лихорадки. Погрешность измерения составляет <0,7C (10x30 мК NETD + неопределенность 0,4C черного тела), при использовании камеры хорошего качества, объектива и черного тела погрешность должна быть значительно меньше этой.

Важно понимать, что все, что покажет камера, это наличие повышенной температуры тела. Камера не диагностирует у человека лихорадку, COVID-19 или любое другое заболевание. Как только система указывает на наличие повышенной температуры, необходимо провести процедуры, позволяющие врачу с соответствующей квалификацией и лицензией обследовать человека.

Рабочая среда

• Станция скрининга должна быть расположена около входа на объект, чтобы минимизировать потенциальные взаимодействия любого зараженного человека.
• В помещении или в хорошо укрытой/защищенной зоне для соответствия нижеуказанным требованиям:
  
  • Минимальный поток воздуха, то есть не под каналом кондиционера или при боковом ветре
  • Наличие функции климат-контроля, в идеале от 20C до 24C и относительная влажность <50%
  • Неотражающий фон, светлый цвет матовой отделки стен отлично подойдет
  • Отсутствие источников теплового излучения, т.е. никаких отражений от солнца, фасадных горячих/холодных окон, потолочных галогенных ламп и т. д.
• Не устанавливайте систему скрининга возле ванных комнат, влажное лицо изменит измерения

Вторичный скрининг

• Камера не диагностирует какое-либо заболевание, она только определяет потенциальную повышенную температуру тела (EBT).
• Если определено, что у кого-то есть EBT, квалифицированный медицинский персонал должен оценить человека с помощью клинического термометра во вторичной области скрининга.
• Это должно быть расположено так, чтобы позволить удаление человека с EBT из учреждения с разумной конфиденциальностью и с минимальным потенциалом для перекрестного заражения других

Как использовать метод среднего скользящего среднего

Все те же требования в отношении iFoV, mFoV и рабочего расстояния, которые обсуждались выше, действительны для метода скользящего среднего. Наиболее важным фактором, особенно при использовании ручной камеры, является системность, то есть расстояние до человека, параметры измерения и т. д.

Самое простое в развертывании решение для мониторинга повышенной температуры тела это использовать одну из портативных камер FLIR (или других производителей, получивших одобрение управления США по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) и имеющих такую возможность примеч. переводчика) в режиме скрининга. Это ссылка на несколько коротких видео, показывающих, как это работает.

Также доступно программное обеспечение, работающее на компьютере под управлением Windows, которое может выполнять метод скрининга скользящего среднего с любым из карманных компьютеров FLIR или установленных камер (серии A). Камеры должны соответствовать минимальным техническим требованиям: разрешение 320x240 пикселей с фокусируемой оптикой.

Резюме

Тепловизионная технология великолепна. Она имеет множество фантастических применений и может эффективно использоваться для скрининга при повышенной температуре тела. Тем не менее, важно понимать ограничения технологии. Тепловизионные камеры производят красивые снимки, которые позволяют очень легко поддаться ложному чувству безопасности, что все в порядке. Существует множество тепловизионных камер, которые никогда не были предназначены для точного измерения температуры, которые быстро рекламируются и продаются как камеры обнаружения коронавирусов. Ни одна камера не может обнаружить коронавирус. Камера может измерять только разницу температур поверхности, что может указывать на повышенную температуру тела и проблему с этим человеком. Только лицензированный медицинский работник может определить, имеет ли горячий человек аномальное состояние здоровья.

Эта технология может оказать большую помощь в этот период кризиса. Но, пожалуйста, не соглашайтесь на то, что это серебряная пуля, это очень маленькая часть очень большого решения огромной проблемы, с которой мы все сталкиваемся вместе.

Одним из основных показателей состояния биологической системы является температура. Если у человека развивается какая-то инфекция, то температура его тела повышается (как правило, но не всегда), что является признаком ответной реакции иммунной системы на угрозу. Другими словами, по температуре можно определить примерное состояние организма. Проблема в том, что человек большой (буквально), а вот, например, нематоды в длину всего лишь около 1 мм. Измерить температуру столь малого организма было крайне сложно, однако ученые из университета Осаки (Япония) разработали методику, позволяющую решить эту проблему. Какие средства были использованы для реализации нанотермометра, что показали практические опыты, и где можно использовать данную разработку? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Температура тела живого организма варьируется в зависимости от степени воздействия внутренних и внешних факторов. Мы привыкли, что температура окружающей среды напрямую влияет на температуру холоднокровных, посему ее значения меняются с завидной регулярностью. Однако даже у теплокровных при нормальных физиологических условиях наблюдаются температурные колебания, которые можно связать с гомеостатической терморегуляцией и энергетическим обменом.

Другими словами, тут отлично подходит шутка: я не бездельничаю, я очень занятой человек на клеточном уровне. Если точно измерить температуру и ее динамику в субмикронном масштабе, то можно получить много информации касательно клеточной и молекулярной активности. Проблема в том, что с уменьшением объекта измерения увеличивается сложность его проведения (сложно засунуть в нематоду обычный термометр из аптеки).

Авторы исследования отмечают, что обычные электрические термометры не имеют субмикронного разрешения, а термография в ближнем инфракрасном диапазоне обычно помогает определять температуру поверхности биологических образцов, но не внутреннюю температуру.

Конечно, сейчас уже есть светоизлучающие нанотермометры (например, термочувствительные молекулярные зонды), которые способны преодолеть это ограничение. Но у такой методики также есть недостатки. Основной это долговременная устойчивость, а точнее ее отсутствие. Подобные устройства не могут точно измерять изменения температуры, которые протекают длительное время (скажем пару часов). Не говоря уже о токсичном воздействии на образец со стороны такого термометра.

В данном труде ученые описывают концепцию наноалмазного (ND от nanodiamond) квантового термометра, который обладает высокой точностью, устойчивостью и низкой токсичностью. Принцип его работы таков: датчик считывает температуру как сдвиг частоты оптически детектируемого магнитного резонанса (ODMR от optically detected magnetic resonance) дефектных центров азотных вакансий (NV от nitrogen-vacancy), который в основном возникает из-за теплового расширения решетки. Сенсорное ядро NV глубоко встроено в решетку алмаза и невосприимчиво к различным биологическим факторам окружающей среды. Внедрение этого квантового датчика в более сложные организмы позволяет считывать их тепловую активность на конкретном участке в режиме реального времени. Но процесс реализации такой техники сопряжен с рядом сложностей.


Нематода (круглый червь) вида Caenorhabditis elegans.

Многоклеточные модельные организмы, такие как черви Caenorhabditis elegans, нуждаются в специальной камере, способной вместить тело миллиметрового размера, а сами образцы необходимо быстро анализировать, чтобы сохранить их физиологическое состояние. Квантовые ND термометры движутся намного быстрее, чем в культивируемых клетках, даже если тело обезвожено, что требует использования алгоритма быстрого отслеживания частиц. Кроме того, позиционное перемещение ND и сложная структура тела вызывают существенные колебания обнаруженной интенсивности флуоресценции, что, вероятно, вызовет артефакты измерения температуры. Решение этих проблем на данном этапе исследования сопряжено с подгонкой устройство под индивидуальные особенности анализируемого образца. Вопрос универсальности и легкости в настройке будущего нанотермометра планируется рассматривать в дальнейших работах, а пока внимание было уделено самой концепции и основным принципам работы.


Небольшой ролик, рассказывающий о нематодах.

Результаты исследования

Основой нанотермометра является конфокальный флуоресцентный микроскоп, оборудованный установкой для микроволнового облучения (1А).


Изображение 1

ODMR азотных вакансий можно измерить как уменьшение интенсивности лазерно-индуцированной флуоресценции при применении спин-резонансного микроволнового возбуждения, поскольку спиновое возбуждение активирует нефлуоресцентный путь релаксации из возбужденного состояния в основное состояние (1В).

Камера, куда помещаются образцы, представляет собой одноразовую чашу со стеклянным дном, интегрированную в антенну, которая обеспечивает оптический доступ большой площади (диаметр 12 мм) и простоту использования (1C), подходящую для деликатных образцов, таких как стволовые клетки. Время от захвата червя Caenorhabditis elegans до начала фактического измерения составляет всего 15 минут. Это помогает сохранить жизнеспособность червя и способствует получению большего объема данных о его состоянии.

Кроме того, данная система эффективно объединяет быстрое отслеживание частиц и высокоточную оценку температуры в реальном времени по ODMR смещению NV центров.

При отслеживании частиц система измеряет интенсивность флуоресценции ND вдоль осей xyz микроскопа и фокусируется на соответствующем максимуме флуоресценции каждые 4 секунды (возможен более короткий интервал отслеживания), в течение которых температура оценивается со временем выборки от 0.5 до 1.0 секунды. (2А).


Изображение 2

Методов квантовой термометрии существует несколько, однако в данном труде был использован метод четырехточечных измерений ODMR. Этот метод предполагает, что количество фотонов, зарегистрированных на всех четырех выбранных частотах, линейно масштабируется в соответствии с изменениями обнаруженной интенсивности флуоресценции.

Однако, было обнаружено, что каждый последующий фотон показывает разницу в светочувствительности около 0.5%, что фактически создает существенные артефакты в оценке частотного сдвига (т.е. 300 кГц, что соответствует нескольким градусам Цельсия), особенно при низко-фотонном режиме.

Эти артефакты, скорее всего, возникают из-за зависимой от оптической мощности асимметрии спектра ODMR. Для точного измерения температуры сложных оптических динамических систем (т.е. биологических систем) от подобных артефактов необходимо избавляться. Поэтому в метод четырехточечных измерений был добавлен фильтр коррекции ошибок.

Для оценки работы системы, сопряженной с коррекцией ошибок, в реальном времени были проведены измерения температуры ND во время ступенчатых тепловых событий. Резкие изменения температуры использовать нельзя было, так как внезапные изменения температуры вызывают большую расфокусировку фокальных пятен и связанные с ними флуктуации интенсивности флуоресценции.

На 2B показаны временные профили общего количества фотонов (I_tot) и температурная оценка ND (T_NV), когда температура образца (T_S) изменяется от 44.3 30.4 44.3 с шагом в 2.8. Система точно выдает T_NV, соответствующий T_S, при этом положение фокуса существенно перемещалось, особенно вдоль оси z на расстояние более 30 мкм (2C).

При шаге в 3 проявляется позиционный сдвиг по оси z на 6 мкм в течение 3-4 минут, но скорость слежения достаточно высока, чтобы следовать динамике 105 нм/с в течение 96 минут (2С).

Кроме того, T_NV четко демонстрирует антикорреляцию с I_tot. Статистическое исследование этого типа температурной зависимости определяет средние значения для SD: I_tot^-1dI_tot/dT = -3.9 0.7 %/С и dD/dT = 65.4 5.5 кГц/С (2D). При этом точность измерения температуры составляет 0.29 и < 0.6 C, соответственно, что дает чувствительность 1.8 C/Гц.

После достижения надежной и точной термометрии в реальном времени в рамках этапа разработки, был проведен тестовый локальный мониторинг температуры на живых червях.


Изображение 3

На снимке 3А показаны ND внутри анестезированных червей, помещенных рядом с микроволновыми антеннами. Эти ND хорошо диспергируются в воде за счет поверхностной функционализации полиглицерина (PG от polyglycerol) и вводятся путем микроинъекции в гонады (половые железы подопытного червя).

На графике 3В показан ODMR спектр одиночного ND (отмечен стрелкой на 3А). 3С демонстрирует временные профили I_tot и T_NV за период в 1 час при изменении температуры T_S.

Сначала проводилось измерение T_obj при 33.2 С, через 6 минут было выполнено уменьшение до 25.3 С. В результате Tobj достиг уровня 28.6 С на 35.2 минуте. T_NV показал точное изменение температуры между двумя стационарными состояниями: 33.2 и 28.6 С.

Отображение реальной динамики температуры внутри червей между этими двумя стационарными состояниями отображается за счет того, что T_NV всегда отстает от T_S и демонстрирует немного заниженный отклик из-за конечной теплоемкости объектива микроскопа и окружающей среды. I_tot также показывает постепенные изменения интенсивности флуоресценции, вызванные температурой.

Отслеживание частиц также выполнялось на удовлетворительном уровне (3С). В течение 0-15 минут в подсчитанных фотонах появляются частые всплески, возникающие из-за позиционных флуктуаций ND приблизительно на 400 нм в течение нескольких секунд.

Результаты теста отчетливо свидетельствуют о высокой точности измерения температуры внутри наноразмерной биологической системы в реальном времени. Далее было решено провести дополнительные тесты, перед которыми подопытные черви прошли фармакологическую обработку с помощью C₁₀H₅F₃N₄O (FCCP от карбонил цианид-4- (трифторметокси) фенилгидразон), вызывающую неподвижный термогенез (грубо говоря, повышение температуры ввиду увеличения метаболизма и без дополнительной мышечной активности).


Изображение 4

На снимке 4А показаны ND у червей, стимулированных FCCP. А на графике 4В показан временной профиль T_NV ND, отмеченного стрелкой на снимках.

На седьмой минуте после начала измерения был использован раствор FCCP. На 32-ой минуте T_NV начинает постепенно увеличиваться, а на 48-ой наблюдается еще большее дополнительное увеличение, когда уровень изменения температуры повышается от 4 до 7 С. Состояние повышенной температуры длилось около 80 минут.

Во время стимуляции ND медленно перемещаются на несколько микрометров в течение часа, что подтверждает результаты отдельных экспериментов, в которых ND непрерывно наблюдались под микроскопом.

Контрольная группа червей (4С и 4D), которым не вводили FCCP, показала равномерный отклик T_NV во время всего теста без каких-либо явных изменений температуры.

Для дополнительного подтверждения того, что FCCP реально вызывает повышение температуры тела червей, была проведена количественная оценка червей с помеченными ND как в контрольной, так и в подопытной группе (4Е). График явно говорит о повышении температуры у червей из подопытной группы по сравнению с контрольной.

Другой контрольный эксперимент, в котором буферный раствор не добавлялся, а T_NV отслеживался статически, показывает, что добавление допанта вызывает колебания T_NV на определенном уровне либо из-за изменения температуры, либо из-за артефактов сдвига ODMR. Однако наблюдение подобного сдвига невозможно при добавлении FCCP, что дополнительно подтверждает повышение температуры за счет FCCP у подопытной группы червей (4F).

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном исследовании ученым удалось разработать методику, позволяющую точно измерить температуру внутри наноразмерной биологической системы в реальном времени. Утрировано говоря, им удалось измерить температуру тела червя Caenorhabditis elegans, длина которого составляет примерно 1 мм.

Важно понимать, что измерить что-либо в большом образце гораздо проще, чем в малом. Тем не менее использование наноалмазов, вводимых в тело червей, позволило узнать температуру тела червя в обычных условиях. Эти наноалмазы, попадая внутрь тела, начинают быстро перемещаться. Специально разработанный алгоритм и конфокальный флуоресцентный микроскоп позволили отследить и проанализировать их движение. Полученные данные позволили точно определить температуру тела червя и ее динамику, даже после введения специального вещества, вызвавшего повышение температуры.

Данный труд не только показывает, что квантовые технологии могут и должны применяться в биологии, но и расширяет спектр возможностей в аспекте диагностики различных процессов на макроуровне. Очень часто состояние биологической системы напрямую или косвенно зависит от процессов, протекающих внутри клеток, измерить которые в реальном времени ранее было крайне сложно. Получив больше информации касательно составных элементов системы, можно лучше понять саму систему, что, естественно, позволит эффективнее влиять на ее работу.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Equinix Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?