Пцр

Если вы интересуетесь биологией, тем более если вы преподаете этот предмет, то для вас станет полезной моя статья, посвященная подготовке и проведению лабораторных работ по выявлению генетически чужеродного гена в ДНК продуктов питания.
Споры вокруг ГМО, а также непрекращающиеся научно-этические дискуссии о правомерности вмешательства человека в дела Природы / Бога, оставим философам. Констатируем лишь, что профессиональная компетенция современного биолога, биотехнолога, биоинформатика и генетика немыслима без умения исследовать и, при необходимости, изменять гены. Уже в школе, а позже в университете, биотехнологические опыты и эксперименты требуют от учеников и студентов постановки четких задач, понимания методологии эксперимента, способности анализировать данные. Всё это развивает любопытство и уверенность, создает фундамент для дальнейшего изучения вопросов и проблем, связанных с научными исследованиями. Мой ПЛАН-КОНСПЕКТ основан на 3-х опытах, проведенных с помощью реактивов BioRad и стандартного оборудования, необходимого для проведения ПЦР-анализов. Но, конечно, можно использовать любые другие Киты для детекции ГМО. Все нюансы проведения эксперимента (протоколы) детально изложены в сопутствующей к реактивам документации, поэтому подробно останавливаться на них я не буду. Итак, план-конспект несет в себе 2 названия: ПЛАН потому что требуется четко и поминутно спланировать содержание урока, и КОНСПЕКТ ибо необходимо заранее подумать, какой материал преподать детям и на чем сакцентировать внимание, для того чтобы полностью раскрыть цель проводимого эксперимента.

ПЛАН.
Опыт рассчитан на два занятия.
Занятие первое:
1. Теоретическое ознакомление учащихся с основами стратегии выявления ГМО (мишеней для детекции и идентификации).
2. Выделение ДНК из продуктов питания (школьник или студент приносит любой продукт на выбор).
3. Проведение полимеразной цепной реакции.
Занятие второе:
4. Гель электрофорез и дискуссии.
5. Заключительное слово учителя.

КОНСПЕКТ.

Первое занятие.
1. Откуда берутся новые гены и вспомогательные элементы (15-20 минут)
Генетически модифицированные организмы это организмы, которые имеют новую комбинацию генетического материала, полученного с помощью современной биотехнологии. К примеру, с помощью Ti-плазмид Новыми генами и характеристиками генетически модифицированных растений могут быть гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидам (cp4, epsps, gox), устойчивость к вредителям (cry) или гены, изменяющие качество продукции (PG, Bay TE). В клетке сам ген не экспрессируется, для экспрессии требуются дополнительные генетические элементы:

• промотор нуклеотидная последовательность, которая распознается РНК-полимеразой как маркер инициации транскрипции;
• терминатор нуклеотидная последовательность, распознаваемая РНК-полимеразой как сигнал для остановки синтеза молекулы РНК;
• генно-инженерная конструкция функциональная единица (последовательность ДНК), которая обеспечивает перенос и функцию целевых генов в новом организме;
• экспрессионная кассета фрагмент ДНК, который содержит ген и все элементы, необходимые для его экспрессии.

В конструкции плазмиды также присутствует высококонсервативный ген хлоропласта из Фотосистемы II часть световой реакции фотосинтеза, чтобы подтвердить, что жизнеспособная ДНК была извлечена и что отрицательный результат ГМ не связан с нежизнеспособной матрицей.
Идентификацию рекомбинантной ДНК в продуктах питания можно осуществить несколькими способами, как показано на рисунке 1.

Рисунок 1. Идентификация рекомбинантной ДНК в продуктах питания

Наиболее распространенные наборы готовых к использованию реагентов, используемые для определения продуктов ГМО, основаны на идентификации промотора и терминатора. GMO Investigator Kit от BioRad использует ПЦР и электрофорез ДНК для проверки наличия двух различных последовательностей ДНК, связанных с ГМО: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора гена нопалинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens. Эти последовательности ДНК содержатся в > 85% генетически модифицированных растений, допущенных к продаже по всему миру. Новый ген, присутствующий в ДНК положительного контроля epsps. В качестве контроля целостности растительной ДНК, экстрагированной из пищи, ПЦР используется для амплификации части гена хлоропласта фотосистемы II, который является общим для большинства высших растений. Итак, тест нацелен на 3 цели: промотор, терминатор и часть гена хлоропласта фотосистемы II, соответственно в наборе 3 праймера, два из которых (праймеры промотора и терминатора) смешали. Поэтому в наборе 2 флакона: красный ГМО праймеры, используется для определения того, содержит ли продукт питания ГМО, и зеленый растительная Фотосистема II, используемый для определения того, была ли ДНК экстрагирована из растительного материала.
После вступительного слова следует ознакомить учащихся с протоколом выделения ДНК и проведения ПЦР, пошагово объяснить ход эксперимента и акцентировать внимание на особенностях работы с КИТом конкретного производителя.
2. Выделение ДНК из продуктов питания (15-20 минут)
В зависимости от свободных рабочих мест можно разделить детей на группы по 2-3 человека, каждая из которых выбирает для анализа интересующий продукт питания. Чипсы или попкорн, столь любимые школьниками, в качестве исследуемого материала только приветствуются, так как почти весь картофель и кукуруза, из которых производят хрустящие вкусности, несет чужеродные гены и в них очень легко идентифицировать ГМО. Или ягоды, к примеру, клубника, черника, хлеб с зернами подсолнечника. Но желательно заранее условиться, кто какой продукт будет тестировать, потому что КИТы для выделения ДНК рассчитаны на определенные продукты и, к примеру, используемый в данном случае не предполагает выделение ДНК из муки, масла, приправ, кукурузных хлопьев и т.д.
В описанных мной опытах ДНК выделяли из черники, огурца и зерен подсолнечника. Отличительные особенности проведения данного исследования:
1. Предварительное взвешивание пробы (1 гр) и тщательное измельчение с помощью ступы. Измельчение необходимо, чтобы разрушить довольно плотные клеточные стенки растений (чего нет у животных клеток).
2. Выделение с помощью гомогенизированного InstaGene Matrix (хотя, конечно можно использовать детергент) без добавления протеаз (разрушение клеточных протеинов) и без осаждения ДНК с помощью солей, так как соль уже в InstaGene.
3. В КИТе нет сорбента, поэтому без элюции в принципе на этом внимание детей можно и не обращать.
Почему в принципе использовался InstaGene Matrix? Потому что это довольно быстрый способ выделения ДНК в течение 15-20 минут, что значительно экономит время занятия. А также InstaGene хелатирует двухвалентные ионы (к примеру, Mg2), необходимые для ферментов, разрушающих ДНК (например, ДНКаз).
3. Проведением полимеразной цепной реакции
После успешного выделения ДНК из продуктов питания детьми по протоколам производителя подготавливаются ПЦР смеси для 6 пробирок эпиндорф по таблице 1 (10-15 минут).

www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/Bulletin_5290.pdf
После этого 1-я часть эксперимента заканчивается. Учитель сам закладывает пробирки в амплификатор и по протоколу устанавливает режимы амплификации.

Второе занятие.
4. Гель электрофорез и дискуссия (40-45 минут)
Дети приготавливают 3% агарозный гель на ТАЕ буфере. Пока будет длиться электрофорез (200 V 20 минут), можно обговорить вероятные варианты результатов (рисунок 2). И уже после получения фотографий обсудить возможные ошибки.


Рисунок 2. Возможные результаты анализа
www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/Bulletin_5290.pdf
К примеру, в группе детей, кторые тестировали огурцы, не наблюдалось никаких ампликонов (рисунок 3).


Рисунок 3. Гель-изображение электрофореза образца (огурец)
К контроли (-не содержащий ГМО, +содержащий ГМО); T тест проба; М маркер молекулярной массы; PMM праймер фотосистемы II; GMM праймер для ГМО.

Дискуссия по результатам 1 образца: в данном случае в амплификационную смесь не были добавлены праймеры.

Второй опыт тестирование ДНК семян подсолнечника (рисунок 4).


Рисунок 4. Гель-изображение электрофореза образец семена подсолнечника
К контроли (-не содержащий ГМО, +содержащий ГМО); T тест проба; М маркер молекулярной массы; PMM праймер фотосистемы II; GMM праймер для ГМО.

Дискуссия по результатам 2 образца: негативный контроль (гелевый карман 2), в геноме которого не было модифицированных генов, не содержит ампликонов. Это указывает на то, что праймер не распознал участок секвенирования промотора 35S и терминатора NOS. Противоположная картина с обнаружением ампликона примерно из 200 пар нуклеотидов наблюдалась в 6 гелевом кармане (положительный контроль генетически модифицированный контроль). Визуально только один продукт амплификации длиной около 200 пар нуклеотидов был получен в положительном контроле ГМО (гелевый карман 6), но продукты амплификации промотора и терминатора почти одинакового размера (203 п.н. и 225 п.н. соответственно (BioRad)), так что мы можем предположить, что в кармане геля 6 находятся два продукта амплификации. В большинстве исследований промотор 35S и терминатор NOS являются наиболее часто используемыми и могут использоваться для обнаружения модифицированных генов более чем в 85% случаев. Этого метода достаточно, чтобы ответить на вопрос, присутствовали ли указанные выше промотор и/или терминатор, но этого метода недостаточно, чтобы ответить, какие гены были вставлены.
Ампликоны, характерные для гена хлоропласта фотосистемы II, можно найти во всех 3 образцах пищевых продуктов (карманы 1, 3, 5), как в тех, которые содержат модифицированные гены, так и в тех, которые не содержат модифицированных генов. Исследуемые образцы не содержали ампликонов терминатора NOS или промотора 35S (карман 4). Несмотря на то, что опыт был проведен успешно и учащимися был получен однозначный результат, но фото не совсем четкое, как будто мутное. Поскольку это явление распространилось на весь гель, можно сделать вывод, что загрязнение произошло во время приготовления 1х буфера TAE. Вероятно, это была зараженная посуда в лаборатории.
Последний опыт это тестирование черники (рисунок 5).


Рисунок 5. Гель-изображение электрофореза образец черника
К контроли (-не содержащий ГМО, +содержащий ГМО); T тест проба; М маркер молекулярной массы; PMM праймер фотосистемы II; GMM праймер для ГМО.

Дискуссия по результатам 3 образца: после прогона геля агарозный гель просматривают сверху вниз. Во всех 3 образцах пищевых продуктов обнаруживаются ампликоны, характерные для гена хлоропласта фотосистемы II. Полоса может быть видна в отрицательном контроле (с праймерами ГМО), поскольку это генетически свободный контроль, это очень странно. Никаких ампликонов длиной около 200 пар нуклеотидов не ожидалось. Полоса в 200 п.н. также появляется в тестируемом образце (черника) и в положительном контроле. Это указывает на то, что праймер распознал свойство секвенирования промотора 35S терминатора NOS.
А вот почему тест образца черники оказался положительным (генетически модифицированным), то это может быть связано с тем, что черника является естественным трансгенным видом растений.
Вероятно, исследуемый образец является примером вмешательства одного организма в другой организм с использованием почвенных бактерий (tumefaciens). Один из таких примеров естественного трансгенного переноса в чернике уже выявила Татьяна Матвеева, доктор биологических наук, профессор Института генетики и биотехнологии биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Она и ее коллеги из института составили мировой каталог растений с уже секвенированными геномами. Из 275 исследованных видов растений 23 были природными трансгенами. Включая сорт арахиса, сорт грецкого ореха, хмель, тропические фрукты гуавы, цветки гвоздики, суринамскую вишню, клюкву и чернику. (Матвеева, 2019)
Следовательно, есть предположение, что исследованная черника является природным трансгеном.
5. Заключительное слово учителя по результатам 2 занятий
Кажется, что выполнение ПЦР просто, но устранение неполадок может быть более сложным, если нужный ампликон не получен или если возникают неспецифические фрагменты. Чаще всего речь идет о зараженной посуде в лаборатории. Чтобы избежать загрязнения реагентов и подходов ПЦР, необходимо следить за тем, чтобы для каждого процесса дозирования использовались свежие наконечники пипеток. Кроме того, имеет смысл чаще менять перчатки в процессе работы. Помимо этого, всегда следует использовать новые и стерилизованные реакционные сосуды и растворы, и они должны быть должным образом маркированы, чтобы четко отслеживать загрязнение. Может быть множество причин, по которым ПЦР не работает. Для успешной ПЦР необходимо соблюдать различные химические и физические параметры. К сожалению, очень часто бывает, что после ПЦР не удается получить желаемых результатов.
Поскольку даже самые маленькие количества ДНК могут быть обнаружены с помощью ПЦР, чрезвычайно важно избегать загрязнения реакционных смесей ПЦР продуктами ПЦР из предыдущих экспериментов или чужеродной ДНК из других источников.

ИТОГ
Опыт по выявлению ГМО в продуктах питания предназначен для получения практических навыков проведения полимеразной цепной реакции. Несмотря на то, что предложен план-конспект, рассчитанный на 2 занятия перерыв между которыми составляет не менее одного дня, однако типовой сценарий остается на усмотрение преподавателя. Аналитические разделы этого исследования предназначены для того, чтобы направить учащихся через процесс обнаружения и понимания концепций, которые имеют значение для процедур и анализа данных на каждом этапе пути. Есть надежда, что такой подход (по сравнению с тем, что учитель дает студентам всю справочную информацию) сделает все исследование более понятным для большего числа студентов. Пока у учителя есть возможность проверить прогресс и уровень понимания каждой группы (во время 2 занятия), при желании возможна некоторая степень самостоятельности. Такой подход позволяет большему числу учащихся приобрести желаемые навыки, которые были определены выше.

Список использованной литературы:

1. bio-rad, www.bio-rad.com, 03 Februar 2020. [Online]. Available: www.bio-rad.com/de-de/product/gmo-investigator-kit?ID=1128f1a0-662c-4450-ad12-1b3634f4f18b.
2. Matveeva T., Ottem L. (2019). Widespread occurrence of natural genetic transformation of plants by Agrobacterium. Plant Molecular Biology, 101, 415437. DOI: 10.1007/s11103-019-00913-y