Генетика

Физическую боль сложно назвать чем-то приятным, однако это ощущение имеет крайне важное значение в работоспособности нашего организма. Боль является своеобразной сигнализацией, оповещающей о наличии некоего раздражителя, от которого необходимо избавиться. Причиной боли могут быть как физические повреждения тканей или органов (переломы, ушибы, порезы, удар мизинцем об комод и т.д.), так и патологические процессы в организме (инфекции, онкология, врожденные дефекты и т.д.). В любом случае боль помогает как можно раньше и точнее локализовать проблему, требующую внимания. При этом разные люди могут ощущать боль от одинакового источника по-разному, что обусловлено разным болевым порогом. Для одних людей снятия пластыря настоящая агония. А другие спокойно могут уснуть во время лечения зубного канала без анестезии. Боль крайне индивидуальна, но даже тут есть скрытая логика. Ученые из MGH (Массачусетская больница общего профиля, США) установили причину, почему люди с рыжими волосами обладают более высоким болевым порогом. Как цвет волос влияет на восприятие боли, как это связано с кожей, и как можно на практике применить полученные сведения? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

С точки зрения медицины можно выделить два основных типа боли: ноцицептивную и нейропатическую. Первый тип относится к периферическим нервным окончаниям, которые активируются болевыми стимулами в результате повреждения тканей. Второй тип является результатом повреждения или дисфункции центральной нервной системы или периферических нервов. В рассматриваемом нами сегодня труде речь идет о первом типе боли, т.е. о ноцицептивной.

Ранее было установлено, что люди (и мыши) с рыжими волосами обладают отличным от других болевым порогом, повышенной потребностью в неопиоидных анальгетиках и усиленной реакцией на опиоидные анальгетики. Факт отличий был установлен, но причина его существования так и не была определена.

Чтобы понять причину отличия болевого порога у рыжих стоит сначала обратить внимание на причину визуального отличия, т.е. на причину рыжего цвета волосяного покрова. Рыжий цвет обусловлен вариантными аллелями с потерей функции рецептора меланокортина 1 (MC1R) Gs-связанного рецептора, экспрессируемого на меланоцитах (клетках кожи, продуцирующих пигмент). Эти отличительные черты могут каким-то образом влиять и на болевой порог. Чтобы это выяснить, ученые использовали в ходе опытов мышей Mc1r^e/e, которые демонстрируют многие черты рыжих людей: рыжие волосы, синтез красного/светлого пигмента феомеланина, неспособность загорать после воздействия УФ-излучения и увеличение риска рака кожи из-за УФ воздействия.

Результаты исследования

Чтобы первоначально оценить пороги ноцицепции у мышей Mc1r^e/e и проверить роль пигмента в ноцицепции, ученые скрестили мышей Mc1r^e/e с видом-альбиносом, содержащим инактивирующую мутацию гена тирозиназы (Tyr^c/c). У этих мышей количество меланоцитов не изменено, но они не пигментированы. Полученный скрещенный вид (Mc1r^e/e + Tyr^c/c) не отличался от Tyr^c/c вида, поскольку также имел белый окрас.


Изображение 1

Сравнение мышей с разными генетическими изменениями показало, что особи Mc1r^e/e обладают значительно более высоким болевым порогом (давление и температура), чем мыши Mc1r^E/E с генетическим фоном альбиносов (1A и 1B). При этом повышенный болевой порог наблюдался у мышей Mc1r^e/e и в сравнении с Mc1r^E/E без генетичсекого фона альбиносов (1C и 1D). Из этого следует, что MC1R играет важную роль в регуляции ноцицепции, но не зависит от пигментации.

Далее ученые решили проверить, вызваны ли повышенные пороги ноцицепции у рыжеволосых мышей потерей функции MC1R в меланоцитах или в других типах клеток. Для этого было проведено сравнение трех генетически согласованных (C57BL/6J) моделей мышей, которые различаются по количеству меланоцитов.

Мыши с повышенным количеством эпидермальных меланоцитов показали значительно более низкие пороги ноцицепции (1E и 1F), в то время как мыши, лишенные меланоцитов, показали более высокие пороги ноцицепции по сравнению с мышами из контрольной группы (без каких-либо генетичсеких манипуляций; 1G и 1H). Эти данные свидетельствуют о том, что количество эпидермальных меланоцитов (независимо от функции MC1R) действительно может модулировать пороги ноцицепции.

Далее ученые скрестили рыжих мышей с мышами без меланоцитов. Анализ полученных гибридов позволял оценить функцию MC1R в немеланоцитарных клетках. На графиках 1G и 1H видно, что генетическое отсутствие меланоцитов сводит на нет способность MC1R влиять на пороги ноцицепции. Следовательно, влияние на болевой порог осуществляется MC1R именно в меланоцитах, а не в других клетках.

Одним из гипотетических модуляторов повышенного порога ноцицепции у рыжеволосых мышей является -эндорфин продукт посттрансляционного расщепления проопиомеланокортина (ПОМК), который экспрессируется в меланоцитах. ПОМК индуцируется аденозин 3', 5'-циклическим монофосфатом (ациклический АМР или цАМР) в других типах клеток. Следовательно, низкие уровни цАМР в мутантных меланоцитах MC1R может повлиять на экспрессию ПОМК.

У рыжих мышей уровень -эндорфина в плазме был значительно ниже, чем у черных мышей (1I). Однако это еще не означает, что изменения -эндорфина влияют на болевой порог, поскольку направление изменения противоположно фенотипическому изменению, поскольку передача сигналов опиоидов способствует, а не уменьшает анальгезию (уменьшение болевой чувствительности). Более того, уровни -эндорфина в плазме также были обратно пропорциональны порогам ноцицепции у мышей K14-SCF (более высокие числа меланоцитов и более низкие пороги ноцицепции) и мышей Mitf^mi-wh/mi-wh (отсутствие меланоцитов и более высокие пороги ноцицепции).

Из этих данных следует, что количество и функции меланоцитов обратно коррелируют с порогами ноцицепции, несмотря на то, что они напрямую связаны с уровнями -эндорфина.

Для оценки роли меланоцитов в модуляции экспрессии ПОМК относительно MC1R были произведены два дополнительных изменения в меланоцитах мышей: подавление мРНК Mc1r (1J) и стимуляция MC1R с помощью -MSH, т.е. -меланоцит-стимулирующего гормона (1K). В первом случае наблюдалось снижение продукции мРНК ПОМК, а во втором, наоборот, увеличение.

Экспрессия ПОМК не показала статистически значимого снижения в надпочечниках и гипофизе мышей Mc1r^e/e. Это позволяет предположить, что изменения уровня ПОМК в плазме связаны с уменьшением продукции меланоцитов ПОМК, вызванным потерей функции MC1R.

Далее необходимо было установить, является ли повышенный болевой порог результатом адаптации к низкому уровню -эндорфина. Для этого использовалось два типа мышей: у одного была гомозиготная мутация ПОМК, которая экспрессирует все пептиды меланокортина, но не имеет концевой последовательности -эндорфина (нокаут -эндорфин), а у второго типа был дефицит гена рецептора -эндорфина, т.е. -опиоидного рецептора (Oprm1^/).


Изображение 2

Анализ не показал каких-либо значимых эффектов нокаута -эндорфина на болевые пороги у черных и рыжих мышей (2A и 2B). Делеция (потеря участка хромосомы) Oprm1 не влияла на пороги ноцицепции у черных мышей, но устраняла повышенные болевые пороги у рыжих (2C и 2D).

Подобный эффект имели и налоксон (антагонист* широкого опиоидного рецептора), и ципродим (антагонист, специфичный для -опиоидного рецептора). Они оба снижали болевые пороги у рыжих мышей до уровня порогов черных мышей (2E и 2F).

Антагонист* лиганд, который блокирует, снижает или предотвращает физиологические эффекты, вызываемые связыванием агониста с рецептором.

Агонист* лиганд, который при взаимодействии с рецептором изменяет его состояние, приводя к биологическому отклику.

Эти данные предполагают, что повышенные пороги ноцицепции у рыжих мышей зависят от -эндорфин-независимой передачи сигналов опиоидных рецепторов.

Из вышеописанных результатов следует вывод, что более высокая передача сигналов -опиоидных рецепторов в присутствии низких уровней -эндорфина в плазме может быть объяснена усилением регуляции другого эндогенного опиоида, адаптацией -опиоидного рецептора или сокращением пути, который препятствует передаче опиоидных сигналов.


Изображение 3

Прямые измерения циркулирующих опиоидных лигандов динорфина, энкефалина и эндоморфина не выявили существенных различий между рыжими и черными мышами (3A-3C). Учитывая ранее опубликованные данные о различиях между рыжими и черными мышами в их реакции на пентазоцин (агонист -опиоидных рецепторов), было решено продолжить изучение агониста -рецепторов динорфина.

Для этого штамм мышей с нокаутом динорфина был скрещен с рыжими и черными мышами. Однако измеримых эффектов на пороги ноцицепции у рыжих или черных мышей при этом не наблюдалось (3D и 3E). Это означает, что повышение уровня эндогенного (внутреннего) опиоида вряд ли может быть причиной повышения порога ноцицепции.

После проведения фармакологических манипуляций с меланокортином, которые привели к снижению некоторых эффектов морфина, ученые решили исследовать уровни -MSH (агониста меланокортина) в плазме. MSH кодируется в ПОМК, как и -эндорфин.

Учитывая общее происхождение -MSH и -эндорфина, было неудивительно, что уровни первого варьировались у мышей с разной пигментацией. У мышей с большим количеством меланоцитов (черные мыши) уровень -MSH был достаточно высок (4A). А у мышей меньшим количеством меланоцитов (рыжие мыши) уровень был значительно ниже.


Изображение 4

Таким образом, уровень -MSH в плазме мышей менялся в соответствии с болевым порогом, который он моделирует (гипотетически), чего нельзя сказать про -эндорфин.

Чтобы функционально оценить, может ли пропорционально низкий уровень -MSH способствовать повышенным порогам ноцицепции для рыжих мышей, было выполнено фармакологическое исследование. Меланотан II (пептидный имитатор -MSH) снижал пороги ноцицепции дозозависимым образом у самцов рыжих, но не у черных мышей (4B).

Эти результаты подтверждают, что потеря функции передачи сигналов MC1R приводит к увеличению пороговых значений ноцицепции из-за дефицита меланокортина.

Дополнительно был исследован еще один рецептор меланокортина MC4R, поскольку его ингибирование имеет прямое отношение к фармакологическому обезболиванию и нейропатической боли.

Сначала был проверен пептид SHU 9119, противодействующий MC4R и MC3R. SHU 9119 вызывал уменьшение болевой чувствительности (т.е. увеличение болевого порога) при введении самцам черных мышей (4C). Из этого можно сделать вывод, что обезболивающие эффекты SHU 9119 не зависят от Mc1r и, вероятно, связаны с эффектами лиганда на MC4R или MC3R.

Мыши, которые были лишены MC4R, демонстрировали повышенные пороги ноцицепции (4D и 4E). Отсутствие MC4R у черных мышей также привело к повышению чувствительности к опиоидному антагонизму (4F), что наблюдается у рыжих мышей. Значит, порог ноцицепции может определяться балансом между OPRM1 и сигналами MC4R. Фармакологическое замедление OPRM1 привело к восстановлению порогов ноцицепции как у черных, так и у рыжих мышей (4G). При этом применение агониста меланокортина снижало повышенные пороги ноцицепции у рыжих мышей (4B), но никак не влияло на мышей без MC4R (4H). Это наталкивает на мысль, что именно MC4R является ключевым рецептором меланокортина, на который MSH действует как лиганд для снижения порога ноцицепции.

На следующем этапе ученые решили выяснить, периферическая или центральная нервная система больше задействованы в процессе модуляции ноцицепции. Ноцицептивная разница, наблюдаемая между черными и рыжими мышами, уменьшилась после периферического (внутрибрюшинного) введения налтрексона (5А) антагониста опиоидных рецепторов, который способен преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Гематоэнцефалический барьер* (ГЭБ) физиологический гистогематический барьер между кровеносной системой и центральной нервной системой.

Изображение 5

Однако периферическое введение метилированного налтрексона, непроницаемого для ГЭБ опиоидного антагониста, не уменьшило ноцицептивных различий между черными и рыжими мышами (5В), что свидетельствует о минимальном периферическом влиянии.

Это предполагает, что относительное усиление передачи сигналов опиоидов у рыжих мышей происходит центрально, а не периферически.

Ранее сообщалось, что передача сигналов цАМР играет важную роль в модуляции опиоидного снижения боли. Посему было решено измерить влияние антагонизма на содержание цАМР в первичных нейронах гипоталамуса крыс (RPHN от rat primary hypothalamic neurons). Было обнаружено, что агонист меланокортина увеличивал содержание цАМР, но опиоидный агонист морфин значительно уменьшал вызванное меланокортином повышение цАМР (5C). Следовательно, передача сигналов меланокортином и опиоидами может противодействовать друг другу.

Анализ также показал возможное наличие нейронов в периакведуктальной серой зоне (PAG от periaqueductal gray area), экспрессирующих оба типа рецепторов. Сравнение уровней мРНК опиоидных рецепторов в PAG у разных мышей не показо особых отличий.

Исследование роли PAG в модулировании ноцицепции показало, что местный антагонизм опиоидных рецепторов или агонизм рецепторов меланокортина значительно снижают болевые пороги (5D).

Совокупность всех вышеописанных данных позволяет подытожить: повышенные болевые пороги у рыжих мышей возникают из-за снижения уровней -MSH, вызванного снижением продукции проопиомеланокортина (ПОМК) в меланоцитах, что приводит к снижению передачи сигналов MC4R.

Снижение передачи сигналов MC4R, в свою очередь, снижает его антагонизм по отношению к передаче сигналов опиоидов в ЦНС, которая, несмотря на снижение продукции -эндорфина, не обнаруживает заметных различий в других эндогенных опиоидных лигандах. В совокупности это вызывает дефицит меланокортина, что изменяет баланс в пользу анальгезии (обезболивания), индуцированной -опиоидными рецепторами (5E).

Для более подробного ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Да, легким этот труд не назовешь, но когда дело доходит до изучения работы нервной системы, другого и не стоит ожидать. В данном исследовании ученые пытались разобраться, почему рыжие мыши менее чувствительны к боли, чем черные или белые. Другими словами, почему у них повышенный болевой порог (порог ноцицепции).

В ходе многочисленных опытов удалось выяснить, что у рыжих мышей функции рецептора меланокортина снижены. Это приводит к тому, что клетки кожи, производящие пигмент, выделяют меньше проопиомеланокортина (ПОМК). В свою очередь, молекулы ПОМК расщепляются на гормоны, участвующие в восприятии или блокировке болевых ощущений. Наличие этих гормонов поддерживает равновесие между опиоидными рецепторами и рецепторами меланокортина, которые подавляют и усиливают боль соответственно.

У рыжих мышей уровень обоих гормонов очень низок. Логично, что их действие должно быть минимально. Однако, помимо этих конкретных гормонов существует ряд дополнительных элементов, которые влияют на восприятие/подавление боли. К ним относятся те, что связаны с меланоцитами, которые активируют опиоидные рецепторы, участвующие в блокировании боли. В результате более низкие уровни гормонов приводят к повышению болевого порога за счет усиления опиоидных сигналов.

Естественно, главным применением новообретенных знаний является медицина и фармакология. Понимая индивидуальную природу боли и ее ощущения у разных пациентов, можно более точно применять обезболивающие. Что касается лекарств, то знания о том, какие именно механизмы участвуют в восприятии/блокировки боли, можно разработать препараты, ингибирующие (подавляющие) рецепторы меланокортина, тем самым повышая болевой порог.

Боль играет крайне важную роль в диагностике травм и заболеваний, однако это не означает, что ее нужно терпеть длительное время. Конечно, полностью лишать человека способности ощущать боль было бы крайне неразумно, но иметь в своем распоряжении инструменты, позволяющие ее контролировать, могли бы значительно облегчить жизнь не только медработникам, но и миллионам пациентов во всем мире.


Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?

Если вы интересуетесь биологией, тем более если вы преподаете этот предмет, то для вас станет полезной моя статья, посвященная подготовке и проведению лабораторных работ по выявлению генетически чужеродного гена в ДНК продуктов питания.
Споры вокруг ГМО, а также непрекращающиеся научно-этические дискуссии о правомерности вмешательства человека в дела Природы / Бога, оставим философам. Констатируем лишь, что профессиональная компетенция современного биолога, биотехнолога, биоинформатика и генетика немыслима без умения исследовать и, при необходимости, изменять гены. Уже в школе, а позже в университете, биотехнологические опыты и эксперименты требуют от учеников и студентов постановки четких задач, понимания методологии эксперимента, способности анализировать данные. Всё это развивает любопытство и уверенность, создает фундамент для дальнейшего изучения вопросов и проблем, связанных с научными исследованиями. Мой ПЛАН-КОНСПЕКТ основан на 3-х опытах, проведенных с помощью реактивов BioRad и стандартного оборудования, необходимого для проведения ПЦР-анализов. Но, конечно, можно использовать любые другие Киты для детекции ГМО. Все нюансы проведения эксперимента (протоколы) детально изложены в сопутствующей к реактивам документации, поэтому подробно останавливаться на них я не буду. Итак, план-конспект несет в себе 2 названия: ПЛАН потому что требуется четко и поминутно спланировать содержание урока, и КОНСПЕКТ ибо необходимо заранее подумать, какой материал преподать детям и на чем сакцентировать внимание, для того чтобы полностью раскрыть цель проводимого эксперимента.

ПЛАН.
Опыт рассчитан на два занятия.
Занятие первое:
1. Теоретическое ознакомление учащихся с основами стратегии выявления ГМО (мишеней для детекции и идентификации).
2. Выделение ДНК из продуктов питания (школьник или студент приносит любой продукт на выбор).
3. Проведение полимеразной цепной реакции.
Занятие второе:
4. Гель электрофорез и дискуссии.
5. Заключительное слово учителя.

КОНСПЕКТ.

Первое занятие.
1. Откуда берутся новые гены и вспомогательные элементы (15-20 минут)
Генетически модифицированные организмы это организмы, которые имеют новую комбинацию генетического материала, полученного с помощью современной биотехнологии. К примеру, с помощью Ti-плазмид Новыми генами и характеристиками генетически модифицированных растений могут быть гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидам (cp4, epsps, gox), устойчивость к вредителям (cry) или гены, изменяющие качество продукции (PG, Bay TE). В клетке сам ген не экспрессируется, для экспрессии требуются дополнительные генетические элементы:

• промотор нуклеотидная последовательность, которая распознается РНК-полимеразой как маркер инициации транскрипции;
• терминатор нуклеотидная последовательность, распознаваемая РНК-полимеразой как сигнал для остановки синтеза молекулы РНК;
• генно-инженерная конструкция функциональная единица (последовательность ДНК), которая обеспечивает перенос и функцию целевых генов в новом организме;
• экспрессионная кассета фрагмент ДНК, который содержит ген и все элементы, необходимые для его экспрессии.

В конструкции плазмиды также присутствует высококонсервативный ген хлоропласта из Фотосистемы II часть световой реакции фотосинтеза, чтобы подтвердить, что жизнеспособная ДНК была извлечена и что отрицательный результат ГМ не связан с нежизнеспособной матрицей.
Идентификацию рекомбинантной ДНК в продуктах питания можно осуществить несколькими способами, как показано на рисунке 1.

Рисунок 1. Идентификация рекомбинантной ДНК в продуктах питания

Наиболее распространенные наборы готовых к использованию реагентов, используемые для определения продуктов ГМО, основаны на идентификации промотора и терминатора. GMO Investigator Kit от BioRad использует ПЦР и электрофорез ДНК для проверки наличия двух различных последовательностей ДНК, связанных с ГМО: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора гена нопалинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens. Эти последовательности ДНК содержатся в > 85% генетически модифицированных растений, допущенных к продаже по всему миру. Новый ген, присутствующий в ДНК положительного контроля epsps. В качестве контроля целостности растительной ДНК, экстрагированной из пищи, ПЦР используется для амплификации части гена хлоропласта фотосистемы II, который является общим для большинства высших растений. Итак, тест нацелен на 3 цели: промотор, терминатор и часть гена хлоропласта фотосистемы II, соответственно в наборе 3 праймера, два из которых (праймеры промотора и терминатора) смешали. Поэтому в наборе 2 флакона: красный ГМО праймеры, используется для определения того, содержит ли продукт питания ГМО, и зеленый растительная Фотосистема II, используемый для определения того, была ли ДНК экстрагирована из растительного материала.
После вступительного слова следует ознакомить учащихся с протоколом выделения ДНК и проведения ПЦР, пошагово объяснить ход эксперимента и акцентировать внимание на особенностях работы с КИТом конкретного производителя.
2. Выделение ДНК из продуктов питания (15-20 минут)
В зависимости от свободных рабочих мест можно разделить детей на группы по 2-3 человека, каждая из которых выбирает для анализа интересующий продукт питания. Чипсы или попкорн, столь любимые школьниками, в качестве исследуемого материала только приветствуются, так как почти весь картофель и кукуруза, из которых производят хрустящие вкусности, несет чужеродные гены и в них очень легко идентифицировать ГМО. Или ягоды, к примеру, клубника, черника, хлеб с зернами подсолнечника. Но желательно заранее условиться, кто какой продукт будет тестировать, потому что КИТы для выделения ДНК рассчитаны на определенные продукты и, к примеру, используемый в данном случае не предполагает выделение ДНК из муки, масла, приправ, кукурузных хлопьев и т.д.
В описанных мной опытах ДНК выделяли из черники, огурца и зерен подсолнечника. Отличительные особенности проведения данного исследования:
1. Предварительное взвешивание пробы (1 гр) и тщательное измельчение с помощью ступы. Измельчение необходимо, чтобы разрушить довольно плотные клеточные стенки растений (чего нет у животных клеток).
2. Выделение с помощью гомогенизированного InstaGene Matrix (хотя, конечно можно использовать детергент) без добавления протеаз (разрушение клеточных протеинов) и без осаждения ДНК с помощью солей, так как соль уже в InstaGene.
3. В КИТе нет сорбента, поэтому без элюции в принципе на этом внимание детей можно и не обращать.
Почему в принципе использовался InstaGene Matrix? Потому что это довольно быстрый способ выделения ДНК в течение 15-20 минут, что значительно экономит время занятия. А также InstaGene хелатирует двухвалентные ионы (к примеру, Mg2), необходимые для ферментов, разрушающих ДНК (например, ДНКаз).
3. Проведением полимеразной цепной реакции
После успешного выделения ДНК из продуктов питания детьми по протоколам производителя подготавливаются ПЦР смеси для 6 пробирок эпиндорф по таблице 1 (10-15 минут).

www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/Bulletin_5290.pdf
После этого 1-я часть эксперимента заканчивается. Учитель сам закладывает пробирки в амплификатор и по протоколу устанавливает режимы амплификации.

Второе занятие.
4. Гель электрофорез и дискуссия (40-45 минут)
Дети приготавливают 3% агарозный гель на ТАЕ буфере. Пока будет длиться электрофорез (200 V 20 минут), можно обговорить вероятные варианты результатов (рисунок 2). И уже после получения фотографий обсудить возможные ошибки.


Рисунок 2. Возможные результаты анализа
www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/Bulletin_5290.pdf
К примеру, в группе детей, кторые тестировали огурцы, не наблюдалось никаких ампликонов (рисунок 3).


Рисунок 3. Гель-изображение электрофореза образца (огурец)
К контроли (-не содержащий ГМО, +содержащий ГМО); T тест проба; М маркер молекулярной массы; PMM праймер фотосистемы II; GMM праймер для ГМО.

Дискуссия по результатам 1 образца: в данном случае в амплификационную смесь не были добавлены праймеры.

Второй опыт тестирование ДНК семян подсолнечника (рисунок 4).


Рисунок 4. Гель-изображение электрофореза образец семена подсолнечника
К контроли (-не содержащий ГМО, +содержащий ГМО); T тест проба; М маркер молекулярной массы; PMM праймер фотосистемы II; GMM праймер для ГМО.

Дискуссия по результатам 2 образца: негативный контроль (гелевый карман 2), в геноме которого не было модифицированных генов, не содержит ампликонов. Это указывает на то, что праймер не распознал участок секвенирования промотора 35S и терминатора NOS. Противоположная картина с обнаружением ампликона примерно из 200 пар нуклеотидов наблюдалась в 6 гелевом кармане (положительный контроль генетически модифицированный контроль). Визуально только один продукт амплификации длиной около 200 пар нуклеотидов был получен в положительном контроле ГМО (гелевый карман 6), но продукты амплификации промотора и терминатора почти одинакового размера (203 п.н. и 225 п.н. соответственно (BioRad)), так что мы можем предположить, что в кармане геля 6 находятся два продукта амплификации. В большинстве исследований промотор 35S и терминатор NOS являются наиболее часто используемыми и могут использоваться для обнаружения модифицированных генов более чем в 85% случаев. Этого метода достаточно, чтобы ответить на вопрос, присутствовали ли указанные выше промотор и/или терминатор, но этого метода недостаточно, чтобы ответить, какие гены были вставлены.
Ампликоны, характерные для гена хлоропласта фотосистемы II, можно найти во всех 3 образцах пищевых продуктов (карманы 1, 3, 5), как в тех, которые содержат модифицированные гены, так и в тех, которые не содержат модифицированных генов. Исследуемые образцы не содержали ампликонов терминатора NOS или промотора 35S (карман 4). Несмотря на то, что опыт был проведен успешно и учащимися был получен однозначный результат, но фото не совсем четкое, как будто мутное. Поскольку это явление распространилось на весь гель, можно сделать вывод, что загрязнение произошло во время приготовления 1х буфера TAE. Вероятно, это была зараженная посуда в лаборатории.
Последний опыт это тестирование черники (рисунок 5).


Рисунок 5. Гель-изображение электрофореза образец черника
К контроли (-не содержащий ГМО, +содержащий ГМО); T тест проба; М маркер молекулярной массы; PMM праймер фотосистемы II; GMM праймер для ГМО.

Дискуссия по результатам 3 образца: после прогона геля агарозный гель просматривают сверху вниз. Во всех 3 образцах пищевых продуктов обнаруживаются ампликоны, характерные для гена хлоропласта фотосистемы II. Полоса может быть видна в отрицательном контроле (с праймерами ГМО), поскольку это генетически свободный контроль, это очень странно. Никаких ампликонов длиной около 200 пар нуклеотидов не ожидалось. Полоса в 200 п.н. также появляется в тестируемом образце (черника) и в положительном контроле. Это указывает на то, что праймер распознал свойство секвенирования промотора 35S терминатора NOS.
А вот почему тест образца черники оказался положительным (генетически модифицированным), то это может быть связано с тем, что черника является естественным трансгенным видом растений.
Вероятно, исследуемый образец является примером вмешательства одного организма в другой организм с использованием почвенных бактерий (tumefaciens). Один из таких примеров естественного трансгенного переноса в чернике уже выявила Татьяна Матвеева, доктор биологических наук, профессор Института генетики и биотехнологии биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Она и ее коллеги из института составили мировой каталог растений с уже секвенированными геномами. Из 275 исследованных видов растений 23 были природными трансгенами. Включая сорт арахиса, сорт грецкого ореха, хмель, тропические фрукты гуавы, цветки гвоздики, суринамскую вишню, клюкву и чернику. (Матвеева, 2019)
Следовательно, есть предположение, что исследованная черника является природным трансгеном.
5. Заключительное слово учителя по результатам 2 занятий
Кажется, что выполнение ПЦР просто, но устранение неполадок может быть более сложным, если нужный ампликон не получен или если возникают неспецифические фрагменты. Чаще всего речь идет о зараженной посуде в лаборатории. Чтобы избежать загрязнения реагентов и подходов ПЦР, необходимо следить за тем, чтобы для каждого процесса дозирования использовались свежие наконечники пипеток. Кроме того, имеет смысл чаще менять перчатки в процессе работы. Помимо этого, всегда следует использовать новые и стерилизованные реакционные сосуды и растворы, и они должны быть должным образом маркированы, чтобы четко отслеживать загрязнение. Может быть множество причин, по которым ПЦР не работает. Для успешной ПЦР необходимо соблюдать различные химические и физические параметры. К сожалению, очень часто бывает, что после ПЦР не удается получить желаемых результатов.
Поскольку даже самые маленькие количества ДНК могут быть обнаружены с помощью ПЦР, чрезвычайно важно избегать загрязнения реакционных смесей ПЦР продуктами ПЦР из предыдущих экспериментов или чужеродной ДНК из других источников.

ИТОГ
Опыт по выявлению ГМО в продуктах питания предназначен для получения практических навыков проведения полимеразной цепной реакции. Несмотря на то, что предложен план-конспект, рассчитанный на 2 занятия перерыв между которыми составляет не менее одного дня, однако типовой сценарий остается на усмотрение преподавателя. Аналитические разделы этого исследования предназначены для того, чтобы направить учащихся через процесс обнаружения и понимания концепций, которые имеют значение для процедур и анализа данных на каждом этапе пути. Есть надежда, что такой подход (по сравнению с тем, что учитель дает студентам всю справочную информацию) сделает все исследование более понятным для большего числа студентов. Пока у учителя есть возможность проверить прогресс и уровень понимания каждой группы (во время 2 занятия), при желании возможна некоторая степень самостоятельности. Такой подход позволяет большему числу учащихся приобрести желаемые навыки, которые были определены выше.

Список использованной литературы:

1. bio-rad, www.bio-rad.com, 03 Februar 2020. [Online]. Available: www.bio-rad.com/de-de/product/gmo-investigator-kit?ID=1128f1a0-662c-4450-ad12-1b3634f4f18b.
2. Matveeva T., Ottem L. (2019). Widespread occurrence of natural genetic transformation of plants by Agrobacterium. Plant Molecular Biology, 101, 415437. DOI: 10.1007/s11103-019-00913-y

Судебные специалисты по генеалогии комбинируют традиционные исследования родословных деревьев с базами ДНК. Они идентифицируют останки людей, фигурирующих в нераскрытых уже много лет делах

В августе 1979 года во время розысков наконечников стрел в пещерах гражданской обороны в Айдахо, одной семье не повезло наткнуться на останки человеческого туловища в мешке, спрятанном под слоем осадочных пород толщиной в 20 см. Эти пещеры это лавовые трубки, идущие от Йеллоустонского национального парка, которые во время Холодной войны частично превращали в бомбоубежища.

Личность погибшего, остальные части тела которого не нашлись, и то, как он попал в пещеру к востоку от Дюбуа, с самого начала стали предметом споров. Шериф округа Кларк, Ёрл Холден, считал, что одежде погибшего полосатая рубашка, белая майка, вязаный коричневый свитер, чёрные шерстяные брюки на подтяжках примерно лет 60. В своём отчёте он указал, что в ту эпоху подобную одежду мог носить азартный игрок. Коронер Эрни Сил, лучший друг Холдена, не согласился с ним, и посчитал, что человек погиб не ранее, чем за 10 лет до обнаружения. Даг Убелакер, антрополог из Смитсоновского института, помогавший ФБР в расследовании, посчитал, что останки пролежали в земле от 6 месяцев до 5 лет.

Округ Кларк местность большая, малонаселённая и сельская. Главный город округа Дюбуа, с населением 600 человек (тогда в нём жило 400). Тело подняло шум в местной общине, и стало чёрным пятном на безмятежном ландшафте города но без всякого контекста. В отсутствии подробностей и тестов на ДНК тело стало предметом местных легенд. Эту историю постоянно рассказывали и пересказывали, но в целом дело оставалось нераскрытым.


Человеческие останки, обнаруженные в пещере Айдахо в 1991 году после обнаружения руки без тела

Затем в марте 1991 года во время поисков сокровищ в пещере вместе со своей семьёй, 11-летняя Анна Роджерс отклонилась от группы, ушла в темноту по краю пещеры, и её факел высветил лежащую на земле бледную человеческую руку. Подключившиеся власти быстро отыскали все остальные части тела, завёрнутые в мешковину все, кроме головы. К следствию привлекли бюро расследований Айдахо и ФБР, кости отправили в лабораторию ФБР, а музей естественной истории Айдахо и государственный университет Айдахо запланировали раскопки. Мне хотелось бы найти этот череп, сказал тогдашний шериф Крейг Кинг. По нему сразу стала бы ясной причина смерти. Но систематические раскопки ни к чему не привели.

Убелакер использует эту историю в своих лекциях как пример сложного дела. В своей книге Кости: сборник дел судебного детектива он рассуждает о том, какой психологический эффект могла бы оказать подобная находка на юную Анну Роджерс, и надеется, что она восприняла всё это через детскую призму приключений. Роджерс рассказала мне по емейлу спустя почти 30 лет после находки: Это изменило моё отношение к Дюбуа, он перестал казаться мне таким безопасным. Это был мелкий городок по сравнению с Сиэтлом. Я жалела его, и думала, что его семья может по нему скучать. Также я беспокоилась, что где-то на свободе может ходить убийца.


Пещера в Айдахо, где в 1979 и 1991 годах обнаружили человеческие останки

Энтони Редгрейв не знал своего отца тот ушёл из семьи, когда мальчику было всего три месяца. Энтони рос в Балтиморе, Мэриленд, и в качестве воспоминаний от отца ему осталось несколько артефактов и историй. Две фотографии: одна, на которой он меня держит, одна, где он сидит у нас на кушетке. Плюшевый дракон, подарок от него, который передала мне мама. И кассета с альбомом Some Enchanted Evening группы Blue yster Cult рассказывает он мне по Skype, сидя рядом со своей женой Ли Бингэм Редгрейв в их доме в Массачусетсе. Я о нём ничего не знал, но на одной из фотографий был написан день его рождения.

Энтони всегда увлекался компьютерами. Мальчиком он увлекался наукой, имел творческую жилку, а ещё ему нравилось аниме и песни Боуи. Он ходил в школу изобразительных искусств, и параллельно изучал основы генеалогии (изучение фамильной истории), потому что хотел найти свидетельства присутствия своего отца в онлайне.

С Ли он познакомился в 2006 году на сайте OkCupid, и их общим интересом стали поиски семьи. Ли, росшая в приёмной семье, нашла свою биологическую мать в 18 лет, а позднее смогла отыскать и отца, подтвердив его личность при помощи домашнего ДНК теста от AncestryDNA. Это был первый проект, над которым парочка работала вместе.

Из них получилась хорошая исследовательская команда, разыскавшая контакты с родственниками отца Энтони в конце 2010 года. На следующий день после Дня благодарения я позвонил одной женщине, по поводу которой у меня было подозрение, что она может быть моей тётей, -говорит Энтони. И вот уже телефон передают от одного члена семьи к другому. Теперь у меня больше 100 двоюродных братьев и сестёр и десяток тёть и дядь и это только с одной стороны.


Эми Майкл, Энтони Редгрейв и Ли Бингэм Редгрейв

Ли до этого работала доулой, и проводит параллели между этим занятием и генеалогией. Наука о материнстве это комбинация науки и искусства, неточная наука, поясняет Ли. Как и генеалогия. ДНК это, конечно, наука, но значительная часть генеалогических исследований это искусство, которому нужно учиться. Это странный гибрид. Редгрейвы годами оттачивали своё искусство в качестве побочного заработка, проходили формальное и неформальное обучение, бесплатно помогали приёмным детям в поисках их родителей были кем-то вроде поисковых ангелов. Позднее они начали предлагать такие услуги, как полные отчёты по фамильному древу для платных клиентов.

Затем в январе 2018 года произошёл сдвиг. Их подруга Криста Стил-Кнудслин погибла от рук мужа.

Это убийство их шокировало. Познакомились они со Стил-Кнудслин после самоубийства одного из их друзей, Ларса, в 2008. По их словам, его гибель стала катализатором их погружения в генеалогию, а смерть Стил-Кнудслин заставила их найти в генеалогии более глубокий смысл. Её муж убил её, и мы не могли ничего с этим поделать. Куда девать всю накопившуюся энергию? Ты направляешь её всю в работу, говорит Ли.

Понимая, что в поисковую работу они ушли с головой, чтобы скрыться от реальности, их друг направил парочку на один из постов на Reddit, сделанный новой на тот момент некоммерческой организацией DNA Doe Project [в США неопознанным останкам дают имена John Doe (Джон Доу) для мужчин и Jane Doe (Джейн Доу) для женщин / прим. пер.]. Основали её Маргарет Пресс и Колин Фицпатрик. Эта волонтёрская организация сделала своей целью идентификацию неопознанных останков людей, многие из которых становились жертвами преступлений.

Сначала Редгрейвы возражали против сотрудничества с организацией, занимаясь своим делом. Однако их друг настоял на том, чтобы они наладили с организацией контакт, поскольку их навыки для её задач идеально подходили, и, кроме того, их горю требовался какой-то выход. В итоге мы проговорили с Колином по телефону часа полтора, говорит Ли. Вскоре они взяли на себя руководство командой про работе над одним из первых дел DNA Doe Project.


Помощник шерифа Джон Клементс выходит из пещеры, где завёрнутые в мешковину части тела лежали десятилетиями

Специалисты по генеалогии любят разгадывать загадки. В поисках разгадок они определяют, куда ведут свободно болтающиеся хвостики гобелена с фамильным древом семьи. Под руководством Пресс и Фицпатрик Редгрейвы вошли в мир судебной генеалогии. Это новое направление расследований, сочетающее генеалогические исследования с генетическими данными с тем, чтобы устанавливать личность жертв (а иногда и подозреваемых) в преступлениях. Данные по ДНК обычно берутся у компаний, занимающихся ДНК-тестами для конечного потребителя. Проект DNA Doe Project концентрируется на опознании погибших людей: в США, по некоторым данным, найдены останки не менее 40 000 различных Доу.

У Фицпатрик были связи с правоохранительными органами по всей стране благодаря её компании IdentiFinders, помогающей определять личность при помощи публичных баз данных и Y-ДНК генетического маркера, передающегося от отца к сыну. Новая технология, используемая проектом DNA Doe Project, заинтересовала различные агентства, но не компании Ancestry или 23andMe двух крупнейших игроков на рынке потребительского ДНК-тестирования. Эти компании для получения отчёта по ДНК требуют, чтобы живой клиент отправил им свою слюну, а данные пользователей открывают только правоохранительным органам по официальному запросу. В принципах работы 23andMe записано, что компания решила использовать все практические легальные и административные ресурсы, чтобы сопротивляться требованиям правоохранительных органов.

Чтобы обойти эту проблему, требовалась полная расшифровка генома. Когда-то подобная процедура стоила миллионы долларов, но сегодня можно уложиться в $1500, и точность у неё гораздо выше, чем у отслеживания Y-ДНК. Лаборатория могла бы взять образец ДНК у Доу и создать цифровой отчёт по всему его геному. Важно, что специалист по биоинформатике затем может уменьшить файл от трёх миллионов до порядка 600 000 символов, чтобы добиться совместимости с таким сервисом, как GEDmatch.

GEDmatch открытая база с геномами людей, позволяющая любому человек загрузить расшифровку ДНК, полученную у любой из компаний, работающей с частными лицами, и найти контакты потенциальных родственников, сделавших то же самое. Благодаря недавнему росту популярности ДНК-расшифровок на дому всё больше людей загружают свои ДНК на GEDmatch, что расширяет набор данных. Хотя, пока он ещё все равно слишком маленький, так что у специалистов по судебной генеалогии есть шансы отыскать только троюродных и четвероюродных родственников.

Это был последний шанс, говорит Пресс. Мы не знали, как будет выглядеть ДНК мёртвого, разложившегося тела, и будет ли шанс найти хоть какие-то совпадения. Можно ли будет извлечь достаточное количество ДНК из образцов. Но постепенно всё сработало". Мы разговариваем с Пресс по Skype, и за её спиной я вижу дела, размеченные липкой бумагой для заметок, и сгруппированные: слева раскрытые (30), справа нераскрытые (35).

Правоохранительные агентства и судмедэксперты отправляют старые нераскрытые дела в DNA Doe Project напрямую. Стоимость обработки образцов иногда покрывают пожертвования. Процесс идёт следующим образом: в лаборатории извлекается ДНК неопознанной личности, которую затем секвенируют (иногда в другой лаборатории). В зависимости от количества, загрязнения образцов, деградации или неправильного хранения на это может уйти несколько попыток. Затем специалист по биоинформатике устраняет различие между результатами, полученными в лаборатории, и информацией, закачанной в GEDmatch. Он прогоняет результаты секвенирования (а там могут быть сотни гигабайт данных) через алгоритм, выдающий 13 Мбайт данных, которые уже можно загружать в GEDmatch. После загрузки данных добровольцы ищут в базе совпадения и начинают заполнять данные большого фамильного древа, перечисляя иногда тысячи дальних родственников при помощи уже существующих деревьев и иных документов.


Колин Фицпатрик и Маргарет Пресс

С самого начала в проекте DNA Doe Project работало порядка 12 добровольцев, но с тех пор их число выросло до 60-70, людей не только из США, но и со всего мира, а ещё несколько сотен ожидают своей очереди быть принятыми. Принимаются добровольцы из сообщества специалистов по генеалогии, у которых есть опыт поиска людей, информация о родителях которых отсутствует. Нужно разбираться в том, что делаешь, и знать, насколько сложными могут быть подобные дела, говорит Фицпатрик.

Прорывное дело проекта известно под названием девушка с оленьей кожей. В 1981 году в округе Майами, Огайо, нашли тело убитой женщины. Команда загрузила её ДНК в GEDmatch в марте 2018 года и всего за четыре часа установила её личность. На пресс-конференции было объявлено, что её зовут Марсия Кинг, что родилась она в городе Литл-Рок, Арканзас, и на момент гибели ей был 21 год.

Это произошло всего за две недели до того, как специалист по генетической генеалогии Барбара Рэ-Вентер вместе со своей командой, используя сходные методы, установила личность "убийцы из Золотого штата". Благодаря этому делу судебная генеалогия попала в заголовки газет. Впервые в мире люди узнали о том, что генетическая генеалогия используется и таким способом, говорит Пресс. А потом нам начали поступать горы звонков. Тогда мы поняли, что на наш век работы хватит.

Однако столкнувшись с первыми публичными успехами, судебная генеалогия подверглась более тщательному изучению, из-за чего стали возникать щекотливые вопросы. Например, каким образом правоохранительные органы смогут получить доступ к генетической информации и использовать её. 18 мая 2019 года GEDmatch поменяла политику приватности, по которой пользователи должны явно согласиться на использование их информации правоохранительными органами. Это произошло после инцидента, когда детективам разрешили использовать сайт для поиска преступника, совершившего нападение с применением насилия. При этом сайт разрешал использовать данные только для расследования дел о сексуальном насилии и убийствах. После этого за короткий промежуток времени из базы исчезли совпадения по десятку дел DNA Doe Project. К примеру, двоюродный родственник девушки с оленьей кожей решил не делиться своей информацией с правоохранительными органами. А если бы его профиль был закрыт изначально, девушку бы так и не идентифицировали.

В DNA Doe Project используется похожая база данных, FamilyTreeDNA, и она засветилась в своём собственном скандале. После её открытия она позволила ФБР пользоваться данными пользователей, не сообщая об этом самим клиентам (теперь там можно отказаться от раскрытия своего профиля).

Как и в любой новой области, стандартные практики развиваются постепенно. Идут споры по поводу того, когда можно давать правоохранительным органам доступ к данным ДНК, чтобы они могли устанавливать личности жертв или подозреваемых. В ноябре 2019 года полиция Флориды получила ордер на исследование всей базы GEDmatch, включая и данные тех людей, которые на это не соглашались. Учёные назвали это опасным прецедентом.

Это совершенно новая область, говорит Фицпатрик. Она уже покинула DNA Doe Project, чтобы полностью сконцентрироваться на IdentiFinders. В ней есть и плохие люди. Мы пытаемся действовать максимально аккуратно.


Специалист по судебной генеалогии Энтони Редгрейв

К 2017 году, спустя 38 лет после обнаружения туловища человека в пещерах округа Кларк, поиски черепа ничего не дали. ДНК Джона Доу извлекли и внесли в базы ФБР, CODIS и NDIS, а также в национальную базу пропавших и неустановленных личностей NamUS.

Впервые Редгрейвы узнали об этом случае в 2019 году. Эми Майкл, бывший внештатный адъюнкт-профессор государственного университета Айдахо встретилась с парочкой и пригласила прочесть лекцию для её студентов в университете Нью-Гемпшира. Там она рассказала парочке о загадке, с которой не могло справиться даже ФБР.

Вместе с Самантой Блат, присоединившейся к университету Айдахо в качестве адъюнкт-профессора в 2018-м, Майкл составила биологический профиль тела. В нём было указано, что расчленили тело, скорее всего, после смерти, с использованием различных методов и инструментов, и что явной причины смерти не видно. Человек был, скорее всего, европеоидной расы, имел коричневые или рыжеватые волосы, и, вероятно, возрастом от 25 до 45 лет. Биологический профиль направили заместителю шерифа Джону Клементсу, занимавшемуся этим делом, и с его разрешения в мае 2019 года отправили ДНК в DNA Doe Project.

После извлечения, секвенирования и загрузки ДНК в GEDmatch, команда добровольцев в июле приступила к работе, и под руководством Редгрейвов начала заполнять различные электронные таблицы и семейное древо. Было ясно, что четырьмя часами, как в случае девушки с оленьей кожей, тут не отделаешься. В процессе поисков всплыла распространённая фамилия Лавлейс (Loveless или Lovelace) мормонов-пионеров из штата Юта, практиковавших полигамию. Из-за этого семейное древо превратилось в спагетти, как сказала Ли, что добавило сложности поиску. От одного дедушки или бабушки могло появиться несколько сотен двоюродных родственников. Практиковалась эндогамия и непродолжительные связи, что непредсказуемым образом влияло на распределение ДНК по семейному древу. Не помогали и слишком широкие возрастные рамки, а также временной промежуток для срока от момента смерти до обнаружения тела.

Однако Грег Мэгун, специалист по биоинформатике, обнаружил фамилию Лавлейс в Y-ДНК маркерах в октябре, а потом ещё один доброволец отследил ДНК Доу до одного из предков по отцовской линии, ситуация стала проясняться. Всё перевернулось, потому что сначала я искал родственников по материнской линии, говорит Энтони. Вот тогда петля и начала затягиваться, и мы перешли от 30 возможных кандидатов к трём.

Они изучили троих кандидатов, искали сведения о том, живы ли они, составляли временные шкалы. Два человека явно жили и умерли в другом месте, работая на железных дорогах. Записи с FindAGrave.com показали, что третий, Джозеф Генри Лавлейс, покоится в своей могиле в Пэйсоне, Юта.

Вот только этого не могло быть. Добровольцы заметили, что профиль на FindAGrave у жены Генри, Агнес Лавлейс, был заполнен полностью. Была указана точная дата и причина смерти: 1916, убита топором. На одном из генеалогических сайтов нашлась совпадающая с этим история убийства. Но в профиле Генри на FindAGrave таких записей не было, была указана только дата смерти 1915, которой, при ближайшем рассмотрении, не оказалось на надгробном камне. Там значилось лишь 1870 .


Помощник шерифа Джон Клементс

По телефону работники городского кладбища Пэйсон подтвердили, что дата смерти отсутствует. Оказалось, что один из членов семьи перепутал Генри с его братом Джедедайей, имевшим тот же первый инициал в имени, и затоптанным лошадьми в 1915 году. По ошибке его дату смерти указали в профиле Генри на сайте FindAGrave.

Добровольцы просмотрели вырезки из газет того времени, чтобы найти подтверждение истории жизни Джозефа Генри Лавлейса. Для сегодняшних чувствительных времён его история кажется воистину дикой: он родился в городе Пэйсон на Территории Юты в 1870, был бутлегером, вором и преступником. Его жена Агнес тоже была бутлегером, и погибла от рук некоего Чарльза Смита 6 мая 1916 года. 7 мая в газете Айдахо написали об аресте Уолтера Курранса, также представлявшегося Смитом, за убийство Агнес, его гражданской жены. Несколько дней спустя в другой заметке указали, что Уолтер Кайрнс сбежал из тюремной камеры при помощи спрятанной в сапоге ножовки, и его впоследствии так и не поймали.

В целом у 14 добровольцев ушло более 15 недель на то, чтобы раскрыть это дело, и составить из деревьев 250 родственников общее семейное древо, включавшее в себя 31 730 человек. Когда они вышли на Джозефа Генри Лавлейса, преступника с минимальным количеством официальных записей, и убедились в том, что после 1916 года свидетельств его жизни не имеется, стало ясно, что именно он, скорее всего, был человеком, арестованным за убийство Агнес, а потом сбежавшим вне зависимости от количества использованных им вымышленных имён.

Окончательно Редгрейвсы убедились в том, что тело из пещеры принадлежало Лавлейсу, когда они изучили плакат разыскивается Уолт Кейрнс за убийство Агнес и побег из тюрьмы. Описание внешности Кейрнса совпадало с внешностью его ближайших родственников в частности, очень редкие брови. Также описанная на плакате одежда походила на ту, что нашли на трупе красный свитер, чёрные штаны.

Кто и как его убил, остаётся неясным. Это могли быть члены семьи Агнес, или люди, знавшие её. Его останки хорошо сохранились благодаря уникальной стабильной окружающей среде пещер. И сегодня припасы 1960-х годов, хранящиеся в аккуратных ящиках в бомбоубежище, выглядят как новые. В пещере, где нашли Лавлейса, на потолке есть отложения кальция, а пол состоит из мелкого ила.

5 ноября 2019 года DNA Doe Project отправил в офис шерифа округа Кларк предварительный отчёт, вместе с контактной информацией потомков Лавлейса. Его 87-летний внук вызвался помочь, и помощник шерифа Клементс отправился в 16-часовую поездку из Дюбуа в Калифорнию, прихватив с собой набор для определения ДНК. Внук Лавлейса был пугающе похож на композитное изображение, сделанное Энтони на основе фотографий его родственников и описании. Результаты теста подтвердили родственную связь дедушки и внука.

Энтони Редгрейв и Маргарет Пресс в канун Нового года съездили в Дюбуа на официальную презентацию от шерифа, прихватив с собой Блатт и Майкла. Блатт рассказывала, как в небольшом магазинчике напротив здания, где шла пресс-конференция, люди охали и ахали, узнав, что тело наконец идентифицировали.


Татуировка Джейн Доу на левой руке Ли Бингэм (а на правой есть татуировка Джон Доу).

На следующий день после того, как я впервые пообщался с ними в январе 2020-го, был вынесен приговор бывшему мужу Кристы Стил-Кнудслин. Его приговорили пожизненному заключению с возможностью выхода по УДО через 25 лет. Отец Стил-Кнудслин, Роббер Стил, скромный мужчина со среднего запада, попросил своего адвоката зачитать трогательное финальное заявление.

В мире людей существует немало страхов, некоторые их которых перерастают в самые настоящие фобии: арахнофобия (пауки), акрофобия (высота), аквафобия (вода), коулрофобия (клоуны), офидиофобия (змеи) и т.д. Многие люди, даже не имея офидиофобии, относятся к змеям с призрением и недоверием. Змей часто отожествляют с хитростью, подлостью, коварством и прочими малоприятными качествами, которые по иронии им совершенно неприсущи, в отличие от самих людей. С другой стороны змеи часто символизируют мудрость, бессмертие, знания. Одними из самых узнаваемых символов, в которых присутствует змея, являются сосуд Гигиеи (символ фармации) и посох Асклепия (символ медицины). Для многих самой примечательной особенностью некоторых змей является их яд, структура которого может быть невероятна. Ученые из Клемсонского университета (США) выяснили, что структура яда некоторых змей зависит от того, насколько эволюционно далека друг от друга добыча. Как гастрономические предпочтения змей влияют на их яд, чей яд сильнее, и как полученные знания можно применить на практике? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Многие виды на нашей планете связаны друг с другом. Это вполне логично, ибо есть хищники, поедающие добычу, есть паразиты, не способные жить без носителя, есть симбиотические существа, получающие выгоду от совместного проживания с другими видами. Связь проявляется по-разному, но она одинаково играет важную роль в развитии каждого из участников этой связи. Об этом говорил еще Дарвин, уделяющий внимание в своих трудах корреляции между эволюцией признаков и взаимодействиями видов.

Однако связь не формируется сразу, на это требуется уйма времени, в течение которого происходит процесс естественного отбора. Ученые приводят в пример связь носителя и паразитов. Носитель в ходе эволюции может развить уникальную для каждого вида паразита защиту или же универсальную сразу от нескольких видов паразитов. В таком случае необходимо понять, важно ли количество или все же характеристики взаимодействующих видов.

Сложные черты того или иного вида определяются множеством компонентов, вносящих вклад в окончательный функциональный фенотип, который формируется в зависимости от количества информации в геноме, определенной данными компонентами. Молекулярные признаки, участвующие в антагонистических взаимодействиях, проявляются как модели для связывания сложности признака с разнообразием видовых сообществ, поскольку их сложность может быть точно определена количественно числом и разнообразием уникальных компонентов. Это, по словам ученых, позволяет использовать меры разнообразия, такие как H-индекс Шеннона*, для суммирования сложности той или иной черты вида.

Индекс (или энтропия) Шеннона* был предложен Клодом Шенноном в 1948 году для количественной оценки энтропии в строках текста. Суть модели состоит в том, что чем больше разных букв и чем больше их пропорциональное количество в интересующей строке, тем труднее правильно предсказать, какая буква будет следующей в строке. Энтропия Шеннона количественно определяет неопределенность (энтропию), связанную с этим предсказанием.

Одним из ярчайших примеров взаимодействия видов является использование одним их низ яда для защиты/нападения. Яд нарушает гомеостатические физиологические процессы, быстро делая добычу неспособной сопротивляться либо нападающего неспособным продолжить преследование. Это взаимодействие позволяет понять силы, опосредующие сложность признаков во взаимодействиях хищник-жертва.

Что касается белковых смесей, сложность фенотипа яда может быть определена количественно с помощью хроматографии*.

Хроматография* метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения их физико-химических свойств. Суть метода заключается в распределении вещества между двумя фазами: неподвижная (твердая или жидкая) и подвижная (газовая или жидкая).

Кроме того, транскриптом ядовитой железы напрямую связывает протеом (совокупность белков) яда с генотипом вида. То есть транскриптом является вторым независимым методом определения сложности яда за счет оценки сложности геномной последовательности.

Функциональные исследования змеиного яда выявили несколько примеров разнообразия и специфичности добычи, вызванных эволюционными процессами. К примеру, из-за того, что морские змеи вида Aipysurus eydouxii начали питаться практически исключительно икрой рыб, их яд стал намного слабее, а также были выявлены нулевые и негативные мутации в генах яда.

Любопытно и то, что паралоги* высокоэкспрессированных генов яда одной и той же змеи могут обладать таксономической специфичностью.

Паралоги* последовательности, которые присутствуют в одном и том же геноме, а возникают в эволюции путем дупликации первичной последовательности.

К примеру, яд змей Spilotes sulphureus одинаково смертелен для млекопитающих или ящериц, а яд Bothrops neuwiedi по-разному выполняет прокоагулянтную функцию (свертывание крови) в крови любого из представителей млекопитающих.

В данном труде особое внимание было уделено гадюковым змеям, так как их гастрономические предпочтения были хорошо изучены, что позволяет детально оценить различия в рационе питания и влияние этого фактора на структуру яда.

Большинство гадюк питаются в основном мелкими позвоночными, при этом диета их предков, вероятно, состояла из млекопитающих, ящериц и лягушек. Гремучие змеи (Crotalus и Sistrurus), медноголовые и мокассиновые (Agkistrodon) составляют крупнейшую кладу переднезубых ядовитых змей в Северной Америке, насчитывающую от 45 до 64 описанных видов. Питание этих видов также обладает широким разнообразием. К примеру, Crotalus horridus питается исключительно млекопитающими, а вот Agkistrodon piscivorus conanti не брезгует рыбой, лягушками, млекопитающими, ящерицами, птицами, черепахами и даже змеями.

Яды этих родов змей состоят из 1070 белков из 1525 различных семейств генов. Из этого и происходит разнообразие действия яда: нейротоксическое (нарушение периферической нервной системы), коагулопатическое (нарушение свертывания крови), геморрагическое (образование кровяных сгустков) или миотоксическое (предотвращение релаксации мышц после сокращения) и т.д.

Дабы проверить, какие теории о связи между питанием змей и структурой их яда все же верны, а какие нет, ученые проанализировали рацион змей и измерили протеомную сложность яда и транскриптомную сложность ядовитых желез. Образцы яда и желез были получены от змей Agkistrodon, Crotalus и Sistrurus. В результате была сформирована самая крупная база данных протеомов и транскриптомов ядовитых желез для этой группы на сегодняшний день (68 линий). Была также создана филогения* из 125 неядерных генетических локусов* из транскриптомов, после чего был проведен сопоставительный анализ с рационом змей.

Филогения* результат филогенетического анализа, т.е. процесса выявления и объяснения эволюционных взаимоотношений между видами.

Локус* местоположение определенного гена на генетической или цитогенетической карте хромосомы.

Результаты исследования

Изображение 1

В ходе исследования была получена филогения посредством методов видового древа (схема выше) и конкатенации* с использованием последовательностей от 169 особей, представляющих 46 видов Agkistrodon, Crotalus и Sistrurus.

Конкатенация* объединение объектов линейной структуры в одну (например, слова микро и мир дают микромир). В генетике подход, основанный на конкатенации, представляет собой подход полного доказательства, который объединяет все сопоставления генов в суперматрицу.

Чтобы получить максимальное разнообразие в пределах исследуемой основной клады, выборка была расширена. В нее дополнительно были включены филогенетически отдельные подвиды и линии с описанным филогенетическим разнообразием, что привело к окончательному набору данных о 9 линиях Agkistrodon, 5 линиях Sistrurus и 54 линиях Crotalus.

Полученные деревья были использованы для филогенетического сравнительного анализа взаимосвязи между разнообразием рациона и сложностью яда.

Первый анализ, во время которого оценивалась связь между транскриптомной и протеомной сложностью яда, показал, что между выраженным генотипом и сложностью фенотипа в ядах змей присутствует сильная связь (диаграмма на изображении 1).

Ученые отмечают, что в ходе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) похожие белки могут элюироваться (извлекаться) вместе в виде одного пика на хроматограммах, что потенциально недооценивает сложность фенотипа на уровне отдельных компонентов. Однако применение меры транскриптомной сложности позволяет количественно определять различия между белками, в то время как равный вес всех уникальных последовательностей независимо от длины транскрипта обеспечивает дополнительный акцент на общем разнообразии последовательностей, а не на организации в транскрипты.

Транскриптомная сложность, лежащая в основе ядов, варьировалась в 10 раз между линиями. При этом самый сложный транскриптом был у змей вида Sistrurus tergeminus edwardsii 45191 k-мер (последовательностей из k нуклеотидов); самый же простой транскриптом принадлежал виду Crotalus durissus terrificus 4723 k-мер.

Протеомная сложность яда также значительно различалась: наиболее сложная у Crotalus lepidus lepidus примерно 32 пика белка на хроматограммах; самая простая у Crotalus tigris в среднем 8 пиков.

Реконструкции состояния предков указывают на промежуточный белок (22.3 пика) и транскриптомную сложность (28751 k-мер) у общего предка агкистродонов и гремучих змей. Из этого можно сделать вывод, что с течением времени произошла эволюция как в сторону более простых, так и более сложных ядов.

Разнообразие у змей проявляется не только в аспекте видов, но и в аспекте потребляемой пищи (схема ниже), т.е. видового разнообразия добычи, которое варьировалось от 2.9 до 15 (среднее 6.7) видов и от 118 до 731 (среднее значение = 365) MPD (от million years of divergence, т.е. миллионов лет расхождения*).

Дивергенция (расхождение)* расхождение признаков и свойств у первоначально близких групп организмов в ходе эволюции.

Изображение 2

Наблюдаемые вариации протеомной и транскриптомной сложности яда лучше всего моделировались с помощью MPD добычи по всем альтернативным филогенетическим деревьям, используемым для представления этой взаимосвязи. Кроме того, модели MPD значительно лучше соответствовали данным по сравнению с нулевыми филогенетическими обобщенными моделями наименьших квадратов. Другими словами, используемая модель по MPD показала, что эволюция сама по себе не может объяснить вариативность ядов у змей.

Наряду с положительной корреляцией между сложностью яда и MPD (график ниже), предложенная модель подкрепляет теорию филогенетического разнообразия для эволюции более сложных признаков яда у змей.


Изображение 3

Более детальный анализ показал положительную корреляцию между сложностью яда и MPD добычи, однако не было выявлено связи между видовым разнообразием и сложностью белков яда. Подобная ситуация наблюдалась и при анализе MPD и транскриптомной сложности: корреляция между ними была, но значимой связи между видовым разнообразием и транскриптомной сложностью яда не было.

Далее была выполнена оценка взаимосвязи между транскриптомной сложностью яда и филогенетическим разнообразием добычи на уровне семейства генов для четырех крупнейших семейств генов среди гадюк (SVMP, SVSP, PLA2 и CTL). Значимые положительные корреляции между сложностью транскриптомов и MPD добычи были обнаружены для семейства генов SVMP, SVSP и PLA2 (график ниже). Семейство генов CTL, однако, не показало значимой связи между MPD и сложностью транскриптомики.


Изображение 4

Данный анализ показывает эволюционный ответ на отбор из более филогенетически разнообразной добычи, происходящий через несколько семейств генов.

В заключение была выполнена проверка того, отражает ли филогенетическое разнообразие добычи функциональное разнообразие яда лучше, чем обычное видовое разнообразие.

Анализ аминокислотных последовательностей яда разных змей показал, что MPD добычи в большей степени отражает разнообразие белковых последовательностей в функционально важных элементах яда, чем простое разнообразие видов добычи. Кроме того, разнообразие аминокислотных последовательностей в конкретных аспектах яда может успешно предсказать его сложность.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Эволюцию сложно назвать быстрым и легким процессом, о каком бы виде не шла речь. Каждый живой организм адаптируется к ряду факторов, в числе которых присутствует и окружающая среда, и ее обитатели. Подавляющее большинство видов так или иначе связано друг с другом. Одни являются хищниками, другие добычей, одни паразитами, другие носителями и т.д. Даже обычное проживание на одной и той же территории видов, которые не контактируют напрямую, вносит свой вклад в их эволюционное развитие.

В данном труде ученые установили, что разнообразие рациона змей коррелирует со сложностью их яда. Другими словами, чем разнообразнее гастрономические аппетиты змеи, тем сложнее будет ее яд. На первый взгляд это кажется весьма очевидным выводом. Далеко не все яды одинаково действуют на разных существ. Следовательно, если есть желание лопать всех подряд, яд должен быть сложным и, следовательно, универсально смертоносным.

Несмотря на простоту вопроса, ответ оказался гораздо сложнее и затронул миллионы лет эволюции. При этом было установлено, что среди четырех семейств генов лишь троим можно приписывать связь видового разнообразия добычи и сложности яда. Четвертое семейство (CTL, т.е. лектины типа С) пошли по другому пути. В дальнейшем ученые намерены выяснить, почему имело место именно такое генное распределение обязанностей.

Важность этого исследования заключается в том, что змеиный яд крайне важный элемент многих препаратов, нацеленных на лечение заболеваний сердца, высокого давления, тромбов и т.д. Змей очень много (порядка 3631 видов по данным 2017 года), среди которых разнообразие ядов еще больше. Чем лучше мы понимаем структуру змеиного яд, тем лучше мы сможем его использовать в фармации.


Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?

В кино, литературе и видеоиграх можно часто встретить вариации на тему криогенной заморозки, особенно, если сюжет разворачивается вокруг длительного межпланетного путешествия. Концепция заморозить что-то или кого-то до лучших времен не нова, но за последние годы она стала намного популярнее. Сейчас даже существуют специализированные учреждения, которые могут заморозить человека с неизлечимой болезнью, а потом разморозить его, когда будет изобретено лекарство. Правда, по законам живых людей замораживать нельзя. Успешно разморозить человека, который фактически переступил черту между жизнью и смертью, а потом еще и вылечить его недуг задача для ученых будущего. Криоконсервация может использоваться не только для людей, но и для других организмов.

Плодовые мушки являются важным модельным организмом во многих отраслях науки, посему ученые из Миннесотского университета (США) разработали методику криоконсервации, позволяющую замораживать эмбрионы дрозофилы. Как работает данная методика, с какими трудностями ученым пришлось столкнуться, и насколько успешна созданная разработка? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Drosophila melanogaster, она же дрозофила или плодовая мушка, является без преувеличения уникальным организмом. Это назойливое насекомое, которое в летние месяцы с радостью становится соседом всех любителей свежих фруктов и овощей, играет важную роль во многих исследованиях.


Томас Морган (1866-1945)

В далеком 1909 году Томас Морган использовал плодовую мушку в качестве модельного организма в своих генетических экспериментах. Модельный организм, как это и предполагает сам термин, используются в качестве моделей в процессе изучения каких-либо процессов или явлений живой природы. Чтобы организм стал модельным, он должен соответствовать ряду требований: ученые должны знать о нем максимум, он должен быть простым в разведении, содержании, а время его развития должно быть минимальным.

Дрозофила подходит по всем этим параметрам и не только. Мушки быстро растут, быстро и массово размножаются, смена поколений также происходит быстро, а их эмбрионы прозрачны, что делает дрозофилу идеальным кандидатом для изучения эмбрионального развития животных.

Использование дрозофилы в качестве модельного организма позволило нам сделать множество важных открытий. Неудивительно, что в разных исследовательских лабораториях по всему миру хранится более 160 000 уникальных генотипов дрозофилы.


Внешний вид Drosophila takahashii.

На данный момент поддержание жизни дрозофил полностью ложится на плечи самих ученых, которые должны периодически переносить взрослых особей к свежему корму, постоянно мониторить условия среды обитания, следить за стерильностью (дабы избежать генетического загрязнения) и т.д. Это крайне трудоемкая задача, требующая немало сотрудников, оборудования и ресурсов.

Криоконсервация, напротив, должна быть гораздо проще и выгоднее, не говоря уже о сохранности самих дрозофил и их генетического материала.

Ранее, как заявляют ученые, уже были попытки разработать метод заморозки дрозофил, который испытывался на диком штамме (Oregon R). Однако разработку свернули из-за ее недостаточной воспроизводимости и сложности.

Если же вернуться ближе к теме исследования, а именно к заморозке эмбрионов дрозофилы, то основными проблемами являются введение криопротекторного агента (CPA от cryoprotectant agent), масштабируемость витрификации*, выживаемость эмбриона в зависимости от возраста и генетический фон, зависящий от штамма.

Витрификация* (стеклование) переход жидкости в стеклообразное состояние при понижении температуры.

Проблема, связанная с CPA, проявляется на этапе дехорионации (Drosophila Egg Dechorionation), так как эмбрион становится непроницаем для криопротекторного агента ввиду воскового слоя и желточной мембраны. Если же CPA все же удастся ввести, то требуются большие скорости заморозки и разморозки для достижения криоконсервации посредством витрификации (стеклования). Однако этот процесс крайне сложно масштабировать, если речь идет о тысячах эмбрионов сразу. Не говоря уже о разнице в генетическом фоне разных штаммов дрозофилы, из-за которой заморозка может по-разному влиять на разные штаммы.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые попытались решить вышеописанные проблемы и достичь успешной криоконсервации эмбрионов разных штаммов дрозофилы.

Результаты исследования

Первый этап заморозки эмбриона это определение того, на какой стадии развития его лучше всего замораживать.


Изображение 1

Для этого использовалась имеющаяся коллекция дрозофил, названная М2 (1a). Особи в этой коллекции являются производными от штамма w[1118], а посему обладают прослеживаемым однонуклеотидным полиморфизмом на X-хромосоме и являются гомозиготными, жизнеспособными и фертильными.

Поскольку скорость эмбрионального развития сильно зависит от температуры, необходимо было постоянно мониторить возраст эмбрионов посредством строгого контроля времени инкубации при установленной температуре (например, 20.1 0.05 C). Также контролировались и морфологические особенности путем изучения внешнего вида кишечника (выглядит, как темные участки) эмбриона под микроскопом (кишечник выделен белыми линиями на 1b). При использовании препарирующего микроскопа кишечник приобретал молочный цвет (ниже на 1b).

С 19-ого по 24-ый час инкубации внешний вид кишечника меняется от структуры в форме сердца (19 часов инкубации) до набора из 34 полупараллельных полос, которые лежат перпендикулярно длинной оси эмбриона (20 часов), затем постепенно наклоняется (2122 часа) и в конечном итоге принимает более вытянутую форму (2324 часа).

После криоконсервации эмбрионов на разном этапе их развития была выполнена разморозка. Это позволило оценить степень выживаемости эмбрионов по скорости вылупления (от эмбрионов до личинок) и выживаемости взрослых особей (вылупившиеся личинки окукливание почти взрослые особи). В результате было установлено, что эмбрионы на 22-ом часу развития обеспечивают самую высокую выживаемость после криоконсервации (2a).


Изображение 2

Дело в том, что у эмбрионов в более старшем возрасте начинает формироваться непроницаемый слой кутикулы, препятствуя поглощение CPA, и поэтому выживаемость резко снижается.

Возраст мошек, используемых для сбора эмбрионов, также повлиял на результат криоконсервации. Выживаемость эмбрионов, полученных от более старых мух (9-12 дней), была значительно ниже, чем от более молодых (1-4 дня).

Далее была выполнена процедура стабилизации проницаемости эмбрионов посредством сетчатой корзины и смеси D-лимонена и гептана (сокращенно LH от D-limonene и heptane). Было установлено, что выдержки эмбрионов в LH растворе в течение 10 секунд вполне достаточно для удаления парафина и повышения проницаемости желточной мембраны, вызывая при этом минимальное повреждение. Далее эмбрионы окрашивались в красный цвет с помощью раствора родамина B, а затем с них удалялся восковой слой (1c).

В результате эмбрионы были полностью проницаемы для CPA, содержащего этиленгликоль (EG), пропиленгликоль (PG) и диметилсульфоксид (DMSO), но не для CPA, содержащего сахариды (сахароза, сортибол и трегалоза).

Чтобы ввести CPA в эмбрионы для последующей витрификации, монослой эмбрионов сначала подвергали воздействию проницаемой CPA с низкой концентрацией (13 мас.%). Более 90% эмбрионов сначала потеряли воду и сжались из-за более высокой внешней осмолярности*, за чем последовало набухание, когда CPA проникал внутрь (1c).

Осмолярность* (осмотическая концентрация) суммарная концентрация всех растворенных частиц.

На следующем этапе было выполнено увеличение внутриэмбриональной концентрации CPA за счет обезвоживания путем помещения эмбрионов в CPA с высокой концентрацией (~ 39 мас.%) при 4 C. Обезвоженные эмбрионы стали плоские по форме и имели множество складок на поверхности.

Важно и то, что более высокая внутриэмбриональная концентрация CPA приводит к большей защите от летального образования льда во время последующего охлаждения и повторного нагревания, но также может привести к большей токсичности CPA, особенно при температурах выше нуля. Проанализировал выживаемость при различных концентрациях CPA, ученые установили, что 9 минут дегидратации в 39 мас.% этиленгликоля + 9 мас.% сорбита идеально подходит для успешной криоконсервации, так как снижает затраты реагентов и время выполнения самой процедуры.

После завершения всех подготовительных этапов ученые приступили непосредственно к заморозке эмбрионов. Для того чтобы криоконсервацию можно было использовать сразу на большом количестве эмбрионов, был разработан метод криосетки нейлоновая сетка, прикрепленная к тонкому держателю из полистирола. Сетка размером 2х2 см может вместить около 1700 эмбрионов. Для каждого отдельного опытного захода заморозки использовалось от 200 до 600 эмбрионов.

Когда криосетка вдавливается в раствор CPA, в котором плавают эмбрионы, последние переносятся на сетку, а CPA поднимается (1a).


Изображение 3

Ученые отмечают, что удаление излишков раствора CPA с криосетки непосредственно перед стеклованием уменьшило общую массу на криосетке в 10 раз, тем самым повысив скорость охлаждения/нагревания и выживаемость эмбрионов после криоконсервации (3a-3d).

Другими словами, чем меньше лишнего раствора CPA остается на сетке, тем быстрее будет процесс заморозки и тем больше эмбрионов одновременно можно будет стекловать (3c).

Затем криосетку с эмбрионами быстро погружали в жидкий азот (LN₂) для стеклования и последующего хранения. Выявить успешность стеклования можно было визуально: витрифицированные эмбрионы становились прозрачными, а кристаллизованные (т.е. стеклование прошло неудачно) становились белыми (1c).

Для сравнения был использован другой хладагент SN₂ (slush nitrogen). SN₂ является более молодым вариантом LN₂, который применялся в предыдущих исследованиях для стеклования эмбрионов. В рамках данного эксперимента SN₂ показал более высокую скорость заморозки, но такую же скорость нагревания, как и LN₂. Кроме того, показатели выживаемости в случае использования SN₂ практически не отличались от LN₂. По этой причине было решено продолжить использовать именно жидкий азот, так как SN₂ гораздо сложнее производить (2c).

Факт того, что на криосетке было минимум раствора CPA, играет важную роль и в процессе нагревания. Предыдущие исследования показали, что скорость нагревания крайне важна для выживаемости эмбрионов. Правильное нагревание может даже спасти те эмбрионы, чья заморозка прошла с ошибками (например, образование льда).

Моделирование процесса нагревания показало, что при наличии CPA этот процесс протекает значительно медленнее. К примеру, скорость нагрева падает до 2.4 х 10⁴ C/мин при толщине слоя CPA в 250 мкм (2e-2f).

Если же удалить CPA, то моделирование показывает, что увеличение площади контакта эмбрионов с криосеткой увеличивает скорость начала вторичного нагревания, так как нейлоновая секта нагревается быстрее эмбрионов (3g-3h).

После успешного охлаждения и последующего нагревания необходимо было удалить CPA, присутствующий внутри эмбрионов. Для этого эмбрионы после нагревания подвергались воздействию 15 мас.% раствора сахарозы перед криобуфером (т.е. изотоническим солевым буфером*) для смягчения осмотического шока (повреждение /распад клеток).

Изотонический солевой буфер* состоит из хлорида натрия (NaCl), диспергированного в стерильной воде в концентрации, при которой объем остается в пространстве внеклеточной жидкости (ECF от extracellular fluid). Буфер называется изотоническим, так как он не меняет размер клеток.

Дополнительно был протестирован метод прямой загрузки эмбрионов в изотонический буфер (т.е. без раствора сахарозы). На удивление скорость вылупления таких эмбрионов была такой же, как и при использовании сахарозы, но выживаемость была ниже. Это, по мнению ученых, связано с желточной мембраной, которая помогает избежать чрезмерного набухания обезвоженных эмбрионов.

Результирующая выживаемость вылупившихся и взрослых особей после криоконсервации составила 52.9 6.3 % и 31.8 5.3 %, тогда как выживаемость без заморозки составляла 97% и 89%. Полученные результаты могут показаться слишком малыми, однако для такого рода процедур это весьма внушительные цифры.

В заключение ученые проверили эффективность данного метода криоконсервации на других 24 штаммах мошек (графики ниже).


Изображение 4

В результате было установлено, что использованные первоначально условия проведения процедуры заморозки/нагревания одинаково успешны для всех протестированных штаммов, хоть и были некоторые незначительные отличия.

В частности, для штамма S7 21-часовые эмбрионы обеспечивали более высокую выживаемость после криоконсервации, чем 22-часовые эмбрионы, из-за несколько более высокой скорости эмбрионального развития.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде ученые продемонстрировали методику криоконсервации эмбрионов дрозофилы. Для достижения максимальной выживаемости эмбрионов после охлаждения/нагревания необходимо было учесть несколько важных аспектов и обойти некоторые трудности. К примеру, важную роль играл не только возраст эмбрионов (оптимальный: 22-ой час развития), которые будут подвержены охлаждению, но и возраст родителей (оптимальный: 1-4 дня). Для успешного введения в эмбрионы криопротекторного агента (CPA) была использована методика увеличения проницаемости, основанная на погружении эмбрионов в смесь D-лимонена и гептана. Эта процедура позволяла снять с них парафиновую оболочку и повысить проницаемость желточной мембраны. Но лишний CPA, остающийся на поверхности эмбрионов, мог бы усложнить процедуру охлаждения, потому его необходимо было удалить. Это было сделано посредством криосетки (нейлоновая сетка, прикрепленная к тонкому держателю из полистирола). Очистка эмбрионов от излишков CPA снижала общую массу примерно в 10 раз, тем самым ускоряя процесс заморозки, для которой использовался жидкий азот. А вот удаление CPA из эмбрионов на этапе нагревания происходило за счет погружения последних в раствор сахарозы, что значительно снижало вероятность осмотического шока.

На первый взгляд кажется, что вся эта процедура невероятно сложна. Однако авторы уверяют в обратном. Они даже проверили это, пригласив добровольцев (два старшеклассника), которых обучили проводить криоконсервацию самостоятельно. Новоявленные лаборанты крайне быстро освоились, а выживаемость эмбрионов, с которыми они работали, оставалась на уровне, описанном учеными в их труде.

Несмотря на свои малые габариты, дрозофилы играют крайне важную роль современной науке. Между человеком и дрозофилой много общего, особенно в аспекте генов. Изучение мутантов этого модельного организма позволяет выяснить, как подобного рода генетические изменения могут повлиять на человека, заявляют авторы исследования. Именно потому сохранение взрослых особей и эмбрионов дрозофил для будущих исследований играет столь важную роль.


Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?

Китайские генетики запустили программу исследования диких соевых бобов. Цель найти генетические участки, отвечающие за взаимодействие с полезными бактериями, которые были потеряны в одомашненных соевых бобах. Как пишет издание Американской Ассоциации развития науки EurekAlert! генетики надеются повысить устойчивость сои одного из основных продуктов питания, особенно в Азии к болезням.


Генетика начиналась с бобовых
и постоянно к ним возвращается


Одномашнивание растений и животных стало поворотным этапом в развитии человечества. Селекция работала на увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур, однако искусственный отбор, уход и защита со стороны человека привели к утрате одомашненными видами многих свойств, прежде всего устойчивости ко многим болезням. Генетические исследования дикороссов могут помочь восполнить утраченные функции. Кроме того, получив доступ к генетическому разнообразию дикой сои, ученые рассчитывают значительно улучшить биологическую фиксацию азота у современных сортов соевых бобов, а значит, увеличить их продуктивность.

Есть уже первые результаты. В ходе исследований генетики культивировали несколько линий сои, в которую были интегрированы части ДНК диких соевых бобов. В результате они обнаружили, что некоторые линии по-разному реагируют на разные штаммы полезных бактерий, известных как Sinorhizobium fredii. Оказалось, что разные реакции связаны с наличием или отсутствием у бактериальных штаммов некоторых систем секреции, используемых бактериями для взаимодействия с растительными клетками. В итоге было выявлено, что белок DRR1 активно взаимодействует с бактериями и при этом влияет на развитие корневой системы сои. Подробнее об этом можно узнать здесь.

Следует отметить, что генетические исследования являются важной частью развития глобального рынка FoodNet, который объединяет новые высокотехнологичные направления производства и дистрибуции продуктов питания. Специалисты рассчитывают ускорить процесс селекции видов, выводить новые разновидности животных и растений с заранее заданными и просчитанными свойствами. Лидируют в исследованиях американцы на них приходится около 50% рынка генетических исследований в аграрке, далее идут Швейцария, Германия, Франция, Япония. Доля России сравнительно невелика исследования жестко ограничены федеральным законом 358-ФЗ. Он фактически запрещает выращивать и разводить генно-модифицированые животные и растения на территории РФ. В этих условиях российские специалисты вынуждены искать обходные пути, например, развивать эпигенетику методы, влияющие на работу генов, но не затрагивающие при этом ДНК. Ну и, конечно, надеяться, что ограничения на исследования рано или поздно будут сняты.

Спрос на альтернативное мясо ежегодно увеличивается. По данным исследования рынка FoodTech, ближайшем будущем искусственное мясо займет 10% всего мясного рынка. Во многом это происходит из-за беспокойства потребителей о собственном здоровье, судьбе животных и окружающей среде. Сейчас в ресторанах или на полках супермаркетов уже можно встретить продукты, сделанные из мяса на растительной основе.



Наггетсы из пробирки от Eat Just неотличимы от обычных, просто гораздо дороже. Фото: EAT JUST

Следующим этапом развития отрасли стало так называемое чистое или культивированное мясо. Его выращивают из клеток животных в лабораториях. Несмотря на то, что это направление ещё находится на начальной стадии, первые серьёзные шаги уже сделаны. 2 декабря Сингапур официально разрешил американскому стартапу Eat Just продавать у себя, выращенное в лаборатории куриное мясо, пишет Reuters. Как сообщают в компании это первое в мире разрешение государственного регулятора на продажу чистого мяса.

Первое в мире нормативное разрешение на настоящее высококачественное мясо, созданное непосредственно из клеток животных для безопасного употребления в пищу человеком, открывает путь к предстоящему небольшому коммерческому запуску в Сингапуре, заявили в Eat Just.

Фирма заявила, что мясо будет продаваться в виде наггетсов, добавив, что подробности о запуске продукта появятся позже. Ранее сообщалось, что один наггетс будет стоить 50 долларов. Как видим, ценник совсем немаленький. Вопрос, хватит ли состоятельных сторонников новой пищи (даже в богатом Сингапуре) для окупаемости проекта, пока остается открытым.

Следует отметить, что в России разработками FoodTech продуктов занимаются компании-участники рынка FoodNet. Среди них можно выделить компанию Greenwise, которая производит искусственное мясо на основе растительного сырья.