Биолюминесценция

Насекомые по праву считаются самыми многочисленными и разнообразными представителями фауны. Они живут во всех уголках нашей планеты: от тропических джунглей Амазонки до каменистых берегов Гренландии. Среда обитания в сопряжении с эволюционными изменениями породили множество уникальных видов, чей внешний вид, повадки или гастрономические предпочтения не перестают удивлять. Одними из самых необычных представителей класса насекомых можно с уверенностью назвать светляков, способных излучать свет за счет специальных органов (лантерн). Но не только сам факт свечения удивителен, но и то как он применяется. Ученые из университета Колорадо (Боулдер, США) попытались понять, как у светляков вида Photinus carolinus происходит синхронизация свечения. Как проводилось исследование, чем отличается поведение роя светляков от одиночных особей, и в чем же секрет синхронизации свечения? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Как мы уже поняли, в мире удивительных видов насекомых полно, особенности которых способны поразить воображение даже самого искушенного энтомолога: жук-бомбардир выстреливает горячей жидкостью для самозащиты, палочник в ходе эволюции стал мастером камуфляжа, муравьи столь многочисленны, что занимают около 25% от общей биомассы планеты, а осу вида Ampulex compressa можно легко сравнить с ксеноморфом. Список интересных фактов можно продолжать бесконечно, учитывая что на Земле обитает порядка 6-8 миллионов видов.


Видео о том, как именно светлячки излучают свет.

Светляки это не отдельный вид, а целое семейство, насчитывающее порядка 200 видов. Обитают они как в тропиках / субтропиках, так и в умеренном климатическом поясе, хоть и в меньшем числе. Светляки по большей степени являются ночными насекомыми, что вполне логично, учитывая их особенность (кому нужен фонарик средь бела дня).

На теле светляков имеются специальные органы свечения (лантерны от итальянского lanterna, т.е. лампа). Это может быть либо одиночный крупный орган на конце брюшка, либо множество более мелких органов, расположенных в определенном порядке по всему телу.

Назначение свечения достаточно поэтично поиск партнера. Когда наступает закат самцы светляков начинают летать и светиться, тем самым привлекая внимание самок. Дамы, чаще всего лишенные крыльев, наблюдают за шоу и выбирают самого подходящего кандидата для спаривания.

Что происходит дальше, зависит от вида светляков. Дело в том, что сигнатура свечения у разных видов разная, от чего и язык общения внутри вида разный. Сгруппировать сигналы можно в такие категории: поисковые, призывные, отказные, агрессивные, посткопулятивные (после спаривания). Самцы одних видов испускают призывные и поисковые сигналы, а самки только призывные. А вот самцы вида Lampyris noctiluca испускают исключительно призывные сигналы. У других же видов отличий в сигналах может и не быть вовсе.


На фото представлены личинка (сверху слева), самец (снизу слева) и самка (справа) светляков вида Lamprohiza paulinoi.

Нестандартное поведение наблюдается в сигналах самок из рода Photuris. Они способны излучать свечение, призывающее самцов из другого рода (Photinus). Делают они это не из-за романтических побуждений. Самки Photuris являются хищниками, а самцы Photinus, одурманенные их свечением, становятся ужином. Любопытно, что самцы рода Photuris призывают своих кровожадных дам, излучая свечение самцов Photinus. Когда самка находится достаточно близко, самец переключает подставное свечение на свое собственное.


Самка Photuris, поедающая самца Photinus.

Другими словами, свечение для светляков это самый настоящий язык, т.е. инструмент коммуникации. Тем интереснее синхронное свечение.

Лишь небольшое число видов обладает способностью синхронно светиться. Когда начинается закат, начинается и свечение, достигающее апогея синхронизации спустя 10-15 минут. Столь красивое явление было впервые описано немецким путешественником и натуралистом Энгельбертом Кемпфером (1651-1716), который наблюдал его во время своего путешествия в Таиланд в 1680 году.


Свечение Photinus carolinus, национальный парк Грейт-Смоки-Маунтинс (Great Smoky Mountains National Park).

В рассматриваемом нами исследовании главным героем является вид Photinus carolinus, особи которого обладают даром синхронного свечения.

Ранее проведенные наблюдения за колониями P.carolinus показали, что самцы этого вида синхронно мигают каждые T_f 0.5 с в течение нескольких секунд, а затем коллективно прекращают это делать. Такие циклы происходят каждые T_b 12-14 с в течение 3 часов после захода солнца.

В попытках понять суть синхронного свечения были созданы математические модели. Как показано в этих моделях, для всестороннего понимания коллективного поведения светлячков требуется не только временная, но и пространственная информация о вспышках, которой у исследователей ранее не было. Именно этот пробел и решили заполнить авторы рассматриваемого нами исследования.

Для этого они засняли процесс синхронного свечения с разных ракурсов одновременно, что позволило смоделировать трехмерную модель сего процесса. Во время наблюдений использовались камеры кругового обзора (т.е. 360).


Изображение 1

Как заявляют ученые, подобный подход не использовался ранее в изучении светляков. Обычные камеры позволяют получить достаточно данных в условиях небольших скоплений светляков, но не дают полной картины поведения многочисленных групп особей, так как камеры необходимо размещать за пределами коллективной динамики, а в кард попадает лишь часть происходящего (1а). Камеры кругового обзора можно размещать буквально посреди роя и получать полноценную информацию о происходящем.


Видео 1: поведение светляков в естественной среде, зафиксированное 360-камерой.

Наблюдения за светляками проводились как в естественной среде, так и в контролируемых условиях. Также велось наблюдение и за поведением особей в зависимости от численности роя (1, 5, 15 и 40 особей).

Результаты исследования

Трехмерная реконструкция вспышек в естественной среде обитания (5-минутный интервал, начиная с 22.00) показывает, что рой P. carolinus точно следует по склону окружающей местности и, в частности, мигает почти исключительно на высоте 2 м над землей (2d2g; видео 2).


Изображение 2

При рассмотрении сверху существуют ограничения техники визуализации: вспышки дальше 10 м не фиксируются, а визуальная окклюзия создает значительные слепые зоны. Однако в триангулированных положениях видны четкие полосы света (2d).


Видео 2: реконструкция поведения светляков и их свечения (соответствует изображению 2).

На каждом кадре видеозаписи фиксировалось 0, одна или несколько световых вспышек. Временной ряд количества вспышек (2i и 2j) демонстрирует двойной периодический характер. Вспышки происходят через равные промежутки времени (интервалы между вспышками T_b; 2i), при этом записывается максимум около 15 одновременных вспышек, разделенных периодами абсолютной темноты.

Приблизившись к этим вспышкам (2j), можно увидеть иную временную картину: вспышки (общее для роя) состоят из последовательности нескольких мерцаний (отдельно для особи), происходящих синхронно с четко определенным интервалом между T_f 0.5 с.

Частотный спектр (преобразование Фурье) временного ряда мерцаний дополнительно подтверждает регулярность этих двух процессов, демонстрируя ярко выраженные пики на частотах 1/T_b = 0.08 Гц и 1/T_f = 1.75 Гц (периоды 12.5 с и 0.57 с соответственно; 2k и 2l). Тот факт, что эти частоты появляются в виде резких пиков в спектре, указывает на то, что эти два процесса происходят в четко определенные интервалы времени.

Эти простые количественные результаты демонстрируют, что мерцание P. carolinus является синхронным, прерывистым и точным. Подобные выводы уже делались ранее. Тем не менее ранее считалось, что вспышки прекращаются внезапно, но в ходе наблюдений были отмечены треугольная форма вспышек и периоды медленного затухания свечения (2j). Наличие треугольного узора в свечении может свидетельствовать о распространении информации внутри роя. Опыты в лабораторных условиях подтвердили, что подобные наблюдения не являются погрешностями оценки данных или нарушением работы оборудования.

Эти результаты показывают, что стая самцов P. carolinus представляет собой сильно коррелированную систему. Механизмы, лежащие в основе их коллективного поведения, такие как распространение информации, могут быть раскрыты путем изучения пространственно-временных корреляций.

Каждая из записанных вспышек привязывалась к времени ti и трехмерной позиции xi. Затем для каждой пары вспышек (i, j) вычислялись разделение _ij = |x_j x_i| и задержка _ij = |t_j t_i|.


Изображение 3

Коррелированные пики возникают каждые 12.5 с (3a), что соответствует вспышкам, и каждый из них состоит из серии высоких и низких полос каждые 0.55 секунды (3b), что соответствует интервалам между вспышками. Пространственные корреляции между всплесками (3a) распространяются по всему рою (пик в диапазоне 010 м). Следовательно, всплески вспышек охватывают весь рой.

Также стоит отметить, что наблюдения показали отсутствие взаимодействия между двумя светляками, которые находились слишком близко друг к другу. Это можно объяснить визуальной окклюзией.


Изображение 4

Трехмерная реконструкция наблюдаемого роя также дала возможность понять кинематику движущихся светлячков.

Анализ отдельных периодов (вспышки, охватывающих не менее четырех последовательных кадров) показывает широкий диапазон движений светлячков.

Скорости свечения (v) показывают континуум между неподвижностью и быстрыми полетами со скоростью до 30 см/с (4a). Радиусы кривизны (r_c) также весьма разнообразны, демонстрируя как крутые повороты, так и пролеты по прямой траектории (4b). Ускорение (a = v²/r_c) охватывает два порядка величин с верхним пределом, сравнимым с силой тяжести Земли (4c). Интересно, что распределение rc по сравнению с v показывает две четко определенные ограничивающие ветви (4d). Нижняя ветвь (большая v, маленькая r_c) отмечает режим высокого ускорения, соответствующий резким и быстрым поворотам. Верхняя ветвь предполагает, что медленные и прямые траектории невозможны при движении светлячка.

Далее рассматривались траектории, длящиеся не менее 2 секунд, в течение которых происходило как минимум 4 свечения. Эти траектории демонстрируют разнообразие моделей.

Принимая во внимание горизонтальный ход (r_xy) между конечными точками траекторий, на 4e можно увидеть континуум между почти стационарными траекториями и другими траекториями, которые покрывают расстояние до 1 м. Вертикальный ход (z) распределяется асимметрично (4f), при этом нисходящие траектории обычно проходят дальше. Траектории никогда не бывают полностью вертикальными (большое значение |z| и малое r_xy), но иногда полностью горизонтальными (4h). Это может свидетельствовать о наличии определенных ограничений в возможностях полета насекомых.

Кроме того, отношение длины пути траектории (s) к ее сквозному расстоянию (r) показывает (4g): хотя большинство траекторий довольно прямые, значительная часть кажется очень искривленной и петлеобразной.

Суть разных траекторий полета заключается в разных коммуникационных сигналах и поведенческих особенностях светляков. Например, длинные и нисходящие траектории наблюдались у самцов, ухаживающих за отвечающей самкой, расположенной на земле. А большие горизонтальные траектории могут соответствовать процессу исследования территории.

Следующий этап исследования перенес наблюдения за насекомыми из естественной среды в контролируемые условия. В небольшую камеру (5b) было размещено несколько самцов светляков, что позволило наблюдать за их поведением в зависимости от численности.


Изображение 5

График 5с демонстрирует трехмерную реконструкцию световых вспышек, записанных в камере в течение 15 минут при наличии 40 особей.

За исключением небольшой части точек (около 1%), которые были расположены намного выше других и были удалены с графика, триангулированные точки определяют объем, который очень напоминает геометрию палатки. Массив точек, соответствующий светлякам, практически идеально повторяет форму тестовой камеры. Заметна даже изогнутость крыши камеры (ткань провисает под собственным весом; 5b).

Ученые не отрицают, что тестовая камера радикально отличается от естественной среды. Однако доступный объем камеры был достаточно большим (около 4 м³), чтобы светляки могли свободно перемещаться и летать, как показывают траектории на 6c.


Изображение 6

Если же в камере находился один самец, он непрерывно генерировал световые вспышки в течение всех 15 минут эксперимента (6a1), даже в отсутствии самки. Продолжительность вспышек обычно составляла от 0.10 с до 0.15 с (510 кадров), хотя также регистрировались и более короткие / длинные вспышки (7a).


Изображение 7

Свечения происходили сериями из 1 до 6 вспышек (чаще всего было 4 вспышки; 7b). Независимо от траектории полета, временной интервал между двумя последовательными вспышками был равен около 0.45 с (2530 кадров). Это видно и по распределению интервалов между вспышками (7c), и по пику 1.75 Гц в частотном спектре (6b1). Вспышки происходили и во время полета, и когда особи просто сидели на стенках камеры (6c1).

Важным наблюдением ученые называют факт того, что временные интервалы между последовательными свечениями (т.е. между сериями вспышек) не имели какой-либо схемы, в отличие от интервалов между отдельными вспышками. Время между свечениями варьировалось от 12 секунд до 1 минуты (7d).

Если же в камере находилось 5 самцов, свечение также происходило на протяжение всего периода наблюдения, но добавились и множественные полеты (6a2 и 6c2). Похоже, что светлячки пытались синхронизировать свое свечение, о чем свидетельствует временное распределение вспышек.

Действительно, большинство свечений состояло из как минимум двух одновременно активных светлячков, вспышки которых происходили синхронно (6a2).

Идентификация траектории, обеспечиваемая пространственной локализацией полос вспышек, позволяет лучше понять возникновение коллективной синхронизации.


Изображение 8

На изображении выше показано, что светлячок, который инициирует свечение, имеет тенденцию мигать дольше всех, а последователи начинают свои собственные вспышки уже синхронизированными.

Последователи могут либо остановиться перед мигающим лидером (8b), либо продолжить движение за ним (8a). Это предполагает, что мигающая информация может передаваться ретрансляционным способом внутри многочисленного роя.

Важно и то, что этапы свечения кажутся апериодическими (например, большой промежуток при t = 200 с на 6a2), однако появление пика на низких частотах (6b2) намекает на некоторую регулярность в схеме коллективного свечения.

Эта закономерность становится более выраженной, когда в камере находится 15 особей. В таком случае свечения возникают в определенном периодическом временном ряду (6a3), а заметные пики (и их гармоники) появляются в частотном спектре при 1/T_b = 0.08 Гц (6b3). Замеренная частота совпадает с той, что была получена во время наблюдений в естественной среде. Любопытно, что эта частота отсутствовала в опытах с одним светляком в тестовой камере. Интервал между вспышками на 1.75 Гц остается таким же, как и у одиночного светлячка (6b3).

Следовательно, это предполагает, что появление четко определенного интервала между всплесками является эмерджентным* свойством коллективного поведения.

Эмерджентность* появление у системы (в данном случае рой светляков) свойств, которыми не обладают ее отдельные элементы (в данном случае один светлячок).

Еще одним важным наблюдением является коллективная кинематика роя во время коллективного свечения. В большинстве свечений виден только один летающий светлячок, в то время как другие стоят или ходят по стенкам камеры (изображение 9 и видео 3).


Изображение 9


Видео 3: реконструкция траекторий полета светляков (соответствует изображению 9).

Траектория полета обычно начинается раньше всех и включает в себя наибольшее количество вспышек. Это наблюдение может быть связано с механизмом, который оптимизирует передачу информации при сохранении коллективных энергетических ресурсов группы. С другой стороны, это может выявить поведенческую дифференциацию.

Когда в камере находилось 40 особей, результаты наблюдений были схожи с теми, что и при наличии 15 особей. Однако в таких условиях имеется больше циклов свечения и больше отдельных вспышек, что позволяет более точно проанализировать процесс.

Вспышки возникают сериями, регулярно растянутыми во времени. Каждая серия состоит из нескольких синхронных вспышек и имеет ту же треугольную форму, что и в дикой природе, при этом количество вспышек медленно увеличивается, достигает максимума и затем медленно уменьшается (6a4). Подобное поведение можно назвать расширением парной синхронизации, наблюдаемой в камере с 5 особями.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Важным отличием данного исследования от предшественников является наличие 360 камеры, что позволила запечатлеть куда больше информации, чем обычные камеры. Получив больше данных в естественной среде, ученые перепроверили их в контролируемых условиях.

Результаты наблюдений в контролируемых условиях с прогрессирующим увеличением численности наблюдаемого роя показывают, что синхронное, прерывистое свечение P. carolinus в дикой природе является результатом индивидуального и коллективного поведения. Хотя интервал между вспышками на 1.75 Гц идентичен для одного светлячка и для группы светлячков, появление четко определенного интервала между вспышками требует наличия множества особей.

Периодичность свечений проявляется, когда в камере находится более 15 особей. В ранее проведенных исследованиях утверждалось, что именно это число особей является минимальным порогом для проявления коллективного поведения.

Каждое свечение состоит из нескольких синхронных вспышек и имеет треугольную форму, аналогичную наблюдаемой в дикой природе. В синхронном свечении всегда участвовало подавляющее большинство особей, чего нельзя сказать про полет, так как лишь некоторые летали, пока остальные оставались неподвижны либо просто ползали по стенкам камеры. Также стоит отметить, что синхронное свечение самцов происходит даже в отсутствии самки, а его продолжительность составляет порядка 15 минут.

Ранее создавались математические модели, которые пытались описать синхронное свечение у светляков. Однако, учитывая ограниченность данных, эти модели не были точны. Хотя многие годы они считались абсолютно достоверными.

Полученные в ходе данного исследования сведения позволяют пересмотреть эти модели, улучшить и доработать их в будущем. Светлячки не синхронизируются за счет какой-то особенной нейронной связи, их поведение является простым копированием того, что делают другие особи в рое. Стоит одному светляку задать ритм, как его тут же подхватывают другие.
Ранее считалось, что синхронное свечение связано с ритуалом ухаживания самцов за самками. Однако тесты показали, что отсутствие самки в камере никак не помешало самцам синхронно светиться. Возможно, суть синхронного свечения заключается не в привлечении самок, а в конкурентной борьбе между самцами. Так или иначе, этот аспект поведения столь удивительных созданий еще предстоит изучить, чем ученые и намерены заняться в будущем.

Кому-то подобные исследования покажутся пустой тратой времени, однако такое утверждение будет слишком радикальным. Мы живем не в отрыве от мира, окружающего нас, а внутри него. Человек от природы любопытное создание, и отрицание проявлений любопытства близко к отрицанию собственной природы. Познание мира не всегда должно иметь какой-то практический смысл и капиталистический подтекст. Порой достаточно того, что мы узнали что-то новое, что-то удивительное и интересное. Знания в большинстве случаев это уже достаточная награда.


Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Equinix Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?

Увидеть танец светлячков в сумеречном свете или свечение волн океана из-за необычных микроорганизмов это захватывающее и даже немного сказочное зрелище из мира дикой природы. Светлячки, к примеру, используют свое свечение для коммуникации, поиска партнера, а порой и для охоты. Для светлячков биолюминесценция является вполне естественным эффектом химических процессов, протекающих в их организме. Человек же может воссоздать подобный эффект с помощью технологий и применить его, к примеру, в медицинской диагностике. Последние несколько лет идет активная разработка различных систем биолюминесцентной визуализации (BLI от bioluminescent imaging), и вот ученые из университета Миссури (США) предложили свой вариант недорогой, простой в использовании и, что самое главное, портативный. В чем особенности устройства, как именно проходит диагностика с его использованием, и насколько точны полученные таким методом данные? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Биолюминесценция у светлячков.

Если рассматривать BLI детальнее, то этот метод основан на использовании в качестве репортера* фермента люцифераза, который генерирует биолюминесцентный свет при окислении его субстрата люциферина.

Репортер* ген, который специально присоединяет к регуляторным последовательностям других генов для исследования проявлений генов в культурах клеток.

Одно из первых применений BLI основывалось на конститутивной экспрессии фермента люциферазы в раковых клетках для мониторинга роста опухоли и метастазирования. Среди более современных применений стоит выделить клеточные зонды на основе люциферина, позволившие расширить спектр применения BLI для функциональной визуализации ферментативных и метаболических процессов. Главный принцип таких зондов основан на том, что люциферин с химическими клетками не является субстратом для люциферазы до тех пор, пока он не высвобождается или не освобождается в результате определенного представляющего интерес биологического процесса (например, селективного ферментативного расщепления; 1a). Интенсивность биолюминесцентного сигнала количественно коррелирует с количеством свободного люциферина, что отражает уровень функциональной активности биологического процесса, который исследуется этим методом.

Несмотря на свои преимущества, нынешние варианты BLI обладают рядом ограничений и проблем. К примеру, текущая система BLI основана на использовании клеток и животных, экспрессирующих трансгенную люциферазу, а потому может применяться к весьма ограниченному числу животных моделей болезней человека.

В дополнение к этому, современные инструменты для визуализации обычно включают небольшой светонепроницаемый черный ящик и охлаждаемую камеру с зарядовой связью (CCD от charge-coupled device) в качестве светового детектора. Эти технические особенности делают BLI стационарным, крайне дорогим и сложным в использовании, а также ограничивают использование BLI только для мелких животных, таких как мыши и крысы. К тому же во время подобных BLI исследований животное должно находиться под длительным наркозом, который может негативно повлиять на его здоровье и нарушить метаболизм.

Результатом вышеописанных технических особенностей является гибель огромного числа животных, ввиду высокоинвазивности методики. В качестве примера ученые приводят токсикологическое тестирование потенциальных терапевтических кандидатов для активации цитохрома P450 (CYP450), фермента печени, ответственного за дезактивацию большинства клинически используемых лекарств. Каждый год от этого тестирование гибнет сотни тысяч собак.

Посему изменение нынешних BLI систем важно не только с точки зрения экономии, простоты использования и точности анализов, но и с точки зрения сохранения жизней.

Чтобы решить эти проблемы, авторы рассматриваемого нами сегодня труда предложили свой вариант BLI устройства, которое они назвали PBL (от portable bioluminescent), т.е. портативная биолюминесцентная система.

Их разработка дает возможность проводить неинвазивные измерения биологических процессов в живом организме с использованием биоразлагаемой инъекционной пробки на основе люциферазы в сочетании с люцифериновым клеточным зондом и высокочувствительным портативным детектором света.

Ученые решили сконцентрировать свое внимание на исследовании ферментативных процессов, так как существует острая потребность в более эффективных методах оценки активности ферментов (например, CYP450) в живом организме. Для исследования возможностей PBL в аспекте внеклеточных ферментов был выбран дипептидилпептидаза 4 (DPP-4), так как этот фермент крайне важен в поиске лекарств от диабета второго типа и некоторых видов онкологии.

Результаты исследования

Изображение 1

На 1b показана схема системы PBL, состоящая из трех основных компонентов:

• функциональный биолюминесцентный зонд соединение люциферина в клетке, которое может распознавать определенный биологический процесс (например, CYP450 или DPP-4; 1a);
• биосовместимая биолюминесцентная светопродуцирующая пробка (репортер) на основе люциферазы или устройство для инкапсуляции клеток;
• портативный датчик (детектор) света.

Как правило, в ходе классического исследования животному сначала вводят однократную дозу люциферинового зонда, инкапсулированного в клетку, с последующей подкожной инъекцией люциферазной пробки спустя несколько минут. Устройство клеточной инкапсуляции с трансплантированными клетками, экспрессирующими люциферазу, используется для длительного мониторинга биологических процессов (до 5 месяцев).

Затем световой датчик немедленно прикрепляется к люциферазной пробке, и биолюминесцентный сигнал записывается через определенные интервалы времени для получения максимального светового потока (1c).

После инъекции инкапсулированного зонда свободный люциферин высвобождается в исследуемом органе (например, в печени) в результате освобождения зонда за счет определенного биологического процесса или фермента (к примеру, CYP450; 1d).

Потом свободный люциферин мигрирует в кровоток и в конечном итоге достигает репортера на основе люциферазы, помещенного под кожу подопытного животного. Количество света, генерируемого люциферазной пробкой, пропорционально концентрации люциферина в кровотоке, что приводит к производству биолюминесцентного света, которое напрямую коррелирует с уровнем функциональной активности биологического процесса, который изучается в ходе конкретного исследования.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые во всех опытах использовали D-люциферин (X = O; 1a; далее по тексту будет просто люциферин). Но это не значит, что их методика работоспособна только с этим типом люциферина, она может быть адаптирована под любые люциферазы и соответствующие им субстраты.

Одним из важнейших элементов устройства является детектор света с высокой чувствительностью и низким уровнем шума, специально разработанный для PBL системы. Особенность этого датчика в том, что он мог отслеживать потоки биолюминесцентных фотонов, которые обычно относительно невелики.

В датчике присутствует большой кремниевый фотодиод (1 см²) в фотоэлектрическом режиме с трансимпедансным усилителем (утрировано говоря, преобразовывает входной ток в выходное напряжение), установленный в цилиндрический корпус диаметром 30 мм и высотой 40 мм. Полученное устройство напоминает стетоскоп и может быть легко применено к маленьким и крупным животным, а также к человеку.

Рабочая поверхность устройства механически защищает чувствительные электронные компоненты и содержит круглую оптическую апертуру диаметром 1 см.

Ученые выбрали фотодиод, а не камеру, по той причине, что первый может работать при комнатной температуре, обладает низкой стоимостью и низким уровнем шума (низкий темновой ток).

Для обнаружения низких уровней освещенности использовался операционный усилитель с низким уровнем шума, сконфигурированный как трансимпедансный усилитель. Коэффициент усиления был установлен на 10¹⁰ В/А с резистором обратной связи R = 10 ГигаОм.

Детектор выводит значение напряжения, которое пропорционально оптической мощности излучения, поглощаемой поверхностью диода:
V = P/r, где P мощность излучения, V напряжение, а r коэффициент пропорциональности, называемый чувствительностью. Для определения r выполнялась калибровка детектора.

Вторым важным элементом системы является инъекционная пробка на основе люциферазы (или коротко люциферазная пробка). Эта пробка содержит рекомбинантный фермент люциферазы вместе с его кофакторами и полимерную матрицу, чтобы фермент и его кофакторы оставались неповрежденными под кожей подопытного (1b и 1c).

Пояснение принципа работы BLI.

Чтобы оптимизировать состав инъекционной люциферазной пробки и добиться яркого стабильного сигнала в живом организме, был проведен тест влияния различных компонентов на светоотдачу с помощью стационарного прибора BLI, оснащенного чувствительной CCD камерой. Анализ показал, что люминесценция, генерируемая люциферазной пробкой, прямо пропорциональна количеству фермента люциферазы, добавленного к пробке, и относительно не зависит от концентрации АТФ в диапазоне 110 мМ.

За счет этих данных был выбран определенный состав люциферазной пробки для всех последующих опытов на мышах (общий объем равен 100 мкл): 83 мкл Matrigel, 10 мкг фермента люциферазы, 10 мМ АТФ, 1 мМ Mg2⁺ и PBS.

Матрица Matrigel была выбрана для этого исследования, так как она нетоксична и легко вводится подкожно, а также производит более яркий и стабильный сигнал по сравнению с другими матрицами. В результате пробка на базе Matrigel сохраняла стабильность в течение 60 минут после инъекции, что позволяло непрерывно измерять биолюминесцентный сигнал.

Поскольку интенсивность света на поверхности зависит от глубины источника света, необходимо было оценить зависимость биолюминесцентного светового потока от глубины люциферазной пробки. Для этого был использован весьма необычный образец кусок мяса из магазина. С его помощью ученые количественно оценили потерю сигнала в зависимости от толщины ткани. Как и ожидалось, интенсивность детектируемого света зависела от глубины источника света.

Любопытно то, что падение интенсивности сигнала не было столь значительным, как ожидалось при использовании обычной люциферазы светлячков (примерно в десять раз на глубине в 0.8 см). Даже на глубине в 1 см был виден отчетливый сигнал.

Далее необходимо было выяснить, пропорционально ли количество света, генерируемого люциферазной пробкой, концентрации люциферина в крови подопытных. Для этого разные концентрации раствора люциферина вводились подопытным внутрибрюшинно, после чего подкожно вводилась люциферазная пробка. После чего биолюминесцентный световой поток непрерывно измеряли для определения максимальной мощности оптического излучения (фотонов в секунду, т.е. максимальный поток фотонов).


Изображение 2

Анализ данных показал, что поток фотонов от люциферазной пробки линейно коррелирует с количеством введенного люциферина в достаточно большом диапазоне дозировок (150, 15 и 1.5 мг/кг). Следовательно, пробка может успешно использоваться для точного определения концентрации люциферина в крови подопытных (2a). На снимках 2b показаны световые сигналы подопытных (полученные с помощью CCD), которым вводили люциферазную пробку и три различных концентрации люциферина.

Далее были проведены аналогичные опыты, но уже с применением портативного детектора света (2c). Результаты (2d) показывают аналогичную линейную корреляцию между концентрацией люциферина и максимальной оптической силой, измеренной портативным детектором света. Даже уровень погрешности обоих методов сопоставим.

Это говорит о том, что метод PBL идеально подходит для высокоточной количественной оценки концентрации свободного люциферина в крови нетрансгенных животных, которые не экспрессируют фермент люциферазы.

На следующем этапе ученые проверяли, насколько эффективен их метод для определения ферментативной активности у живых мышей, а именно активности внеклеточного фермента. Для этого было подготовлено четыре группы мышей (по 5 особей).

Две разные дозы 5 и 10 мг/кг селективного ингибитора DPP-4 ситаглиптина (SIT от sitagliptin) в буфере PBS* вводили двум группам мышей, в то время как третья группа мышей получала чистый PBS (контрольная группа).

Натрий-фосфатный буфер (PBS)* водный раствор солей, содержащий хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия.

Спустя тридцать минут трем группам мышей делали инъекцию люциферинового зонда в клетке DPP-4, а еще через 10 минут подкожную инъекцию люциферазной пробки. Четвертой (контрольной) группу также делали инъекцию пробки, но не вводили люцифериновый зонд.

От всех четырех групп мышей был получен сигнал, зафиксированный как классическим методом (IVIS Spectrum), так и с помощью портативного датчика света.


Изображение 3

Наблюдалось дозозависимое снижение сигнала, полученного от животных, получавших ингибитор DPP-4. Подобные измерения полностью согласовывались между показаниями IVIS Spectrum и портативного светового детектора (3a и 3b).

Из этих результатов следует, что PBL может обеспечить точное считывание внеклеточной ферментативной активности у нетрансгенных животных неинвазивным способом. А полученные таким образом данные сопоставимы с данными, полученными с помощью классической технологии (т.е. IVIS).

Далее было проведено тестирование PBL в работе с внутриклеточными ферментами (CYP450). Для этого был использован CYP450 изофермент цитохром P450 3A (Cyp3a), который является наиболее распространенным и универсальным изоферментом, участвующим в метаболизме лекарственных препаратов.

В этом случае было задействовано две группы мышей. Особям из одной внутрибрюшинно вводили дексаметазон (DEX от dexamethasone, доза 50 мг/кг), который вызывает активацию Cyp3a. Вторая группа мышей (контрольная) получала обычный раствор растительного масла. Через 24 часа обеим группам мышей вводили зонд люциферин-IPATM с последующей анестезией и получением сигнала с помощью IVIS Spectrum.


Изображение 4

На изображениях 4a-4c видно, что биолюминесцентный сигнал от мышей, получивших DEX, был приблизительно в три раза выше, чем сигнал от контрольной группы. Это указывает на то, что зонд может успешно обнаруживать активацию Cyp3a непосредственно в живом организме после обработки мышей дексаметазоном.

Теперь необходимо было провести аналогичные опыты, но с применением метода PBL. Опять же было две группы мышей контрольная и та, которой вводили DEX. Как и ранее, через 24 часа мышам вводили зонд люциферин-IPATM, а потом анестезировали, вводили люциферазную пробку и проводили визуализацию с помощью портативного детектора и IVIS Spectrum (для сравнения).

Как показано на 4d-4f, значительно более сильный биолюминесцентный сигнал был получен от особей с DEX, чем от контрольной группы, как в случае применения IVIS (4d-4e), так и портативного светового детектора (4е).

Одной из важнейших задач, которые поставили перед собой авторы PBL разработки, является возможность проводить неинвазивную визуализацию крупных животных (например, собак) и людей. Прежде всего был выполнен токсикологический анализ, установивший, что никаких отклонений в ответ на D-люциферин у собак не было выявлено.


Далее была выполнена оценка пропорциональности генерируемого люциферазной пробкой света к концентрации введенного люциферина. Собак анестезировали, и люциферазную пробку имплантировали подкожно в брюшную полость. Затем вводили люциферин в различных концентрациях (15, 1.5 и 0.15 мг/кг) внутрибрюшинно с последующим размещением портативного детектора света непосредственно на области люциферазной пробки (5а).

На 5b видно, что максимальный световой выход линейно коррелировал с количеством введенного люциферина в большом диапазоне концентраций люциферина.

Данные, полученные во время тестов на собаках, полностью согласуются с данными тестов на мышах. В некоторых случаях сенсорный сигнал у собак был в 30 раз выше, чем у мышей (при дозе в 15 мг/кг).

В заключение была выполнена оценка эффективности PBL методики в рамках применения ее на людях. Для этих экспериментов было подготовлено 100 мкл люциферазной пробки с тремя различными дозами люциферина (конечные концентрации: 2 мкМ, 200 нМ и 20 нМ) с последующей инъекцией смеси под кожу трупа человека в область плеча (5c). Затем переносной световой детектор помещали непосредственно на люциферазную пробку. Длительность регистрации сигналов составляла 15 минут.

Даже при самой низкой концентрации люциферина наблюдался очень сильный сигнал, в три раза превышающий мощность фонового сигнала. В данном опыте сила сигнала также была пропорциональная концентрации люциферина в широком диапазоне величин (5d).

Для более подробного ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде ученые решили усовершенствовать имеющуюся на данный момент технологию биолюминесцентной визуализации, сделав ее портативной, неинвазивной, легкой в применении и, что самое важное, безопасной для животных и человека.

Принцип работы устройства достаточно прост. В тело вводится зонд для визуализации, который достигает нужного участка (например, печени). Уровень биологической активности участка определяет количество люциферина, которое попадает в кровоток. Когда люциферин достигает области, где размещено устройство, возникает биохимическая реакция с выделением света. Портативный детектор света прикладывается к участку тела, где устройство ближе всего, и замеряет интенсивность света, уровень которого коррелирует с количеством присутствующего люциферина.

Такой способ помогает определить биологические процессы, протекающие в то или ином органе/тканях, в ответ на лечение. Следовательно, медики и ученые, разрабатывающие лекарства, могут понять, работает ли препарат или нет.

Данная разработка также порадует тех, кому не безразлична судьба подопытных животных, которые при обычных условиях могут сильно пострадать или даже погибнуть в ходе биолюминесцентной визуализации. Из-за высокой смертности ученые вынуждены использовать большое число подопытных, чтобы получить необходимый результат того или иного исследования. Неинвазивность PBL метода не только значительно снижает риск для животных, но и нивелирует необходимость в использовании большого числа животных.

Точность портативного PBL не уступает своим стационарным конкурентам, что может сильно ускорить и упростить диагностику пациентов до и во время лечения. Если попытаться одним словом описать, что же PBL в итоге дает, то это слово будет время. Скорость и простота выполнения PBL диагностики экономят драгоценное время медиков, которое в противном случае ушло бы на выполнение какой-то сложной диагностической процедуры без каких-либо гарантий, что она покажет нужные результаты.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?